En avanceret murine model for alkoholfri steatohepatitis i forbindelse med type 2 diabetes
Summary
En enkel og pålidelig kost-induceret gnaver dyremodel for nonalkoholisk steatohepatitis (NASH) er beskrevet, opnået gennem ikke-SPF boliger af dyrene og administration af en bestemt fedtfattig diæt. Vi beskriver identifikation af hepatiske og fedtmæssige immuncelle undersæt for at rekapitulere humane immunologiske tilstande ved at udsætte mus for miljømæssige bakterier.
Abstract
Fedme er forbundet med kronisk lav-grade inflammation og insulinresistens, bidrager til en stigende prævalens af kroniske metaboliske sygdomme, såsom type 2 diabetes og nonalkoholisk steatohepatitis (NASH). Nyere forskning har fastslået, at pro-inflammatoriske immunceller infiltrerer fede hypertrofisk fedtvæv og lever. I betragtning af den nye betydning af immunceller i forbindelse med metaboliske homøostase, der er et kritisk behov for at kvantificere og karakterisere deres modifikation under udviklingen af type 2 diabetes og NASH. Men, dyremodeller, der inducerer patofysiologiske funktioner typiske for menneskelige NASH er sparsom.
I denne artikel giver vi en detaljeret protokol til at identificere immuncelle undersæt isoleret fra leveren og fedtvæv i en pålidelig musemodel af NASH, der er etableret ved at huse højt fedtfattig kost (HFD) mus under ikke-specifikke patogen-fri (SPF) betingelser uden en barriere i mindst syv uger. Vi demonstrerer håndteringen af mus under ikke-SPF betingelser, fordøjelsen af vævet og identifikation af makrofager, naturlige dræber (NK) celler, dendritiske celler, B-og T-celle undergrupper ved flow cytometri. Repræsentative flow cytometri parceller fra SPF HFD-mus og ikke-SPF-mus leveres. For at opnå pålidelige og fortoldelig data, er brugen af antistoffer, nøjagtige og præcise metoder til vævs fordøjelse og korrekt gating i flow cytometri eksperimenter kritiske elementer.
Interventionen med henblik på at genoprette fysiologisk antigen eksponering hos mus ved at huse dem under ikke-SPF-betingelser og uspecifik eksponering for mikrobielle antigener kan være et relevant redskab til at undersøge forbindelsen mellem immunologiske ændringer, diæt inducerede fedme og relaterede langsigtede komplikationer.
Introduction
Fedme er en multifaktoriel lidelse og en stor risikofaktor for udvikling af hjertesygdomme, slagtilfælde, nonalkoholisk steatohepatitis (NASH), type 2 diabetes (T2D) og nogle typer af kræft. Forekomsten af fedme er hastigt stigende globalt. I dag, 2.100.000.000 mennesker-næsten 30% af verdens befolkning-er enten fede eller overvægtige1. Fedme-associeret insulinresistens kan føre til T2D, når udmattet pancreaserlet beta celler undlader at kompensere for det øgede behov for insulin til at opretholde glukose homøostase2.
Fedtvæv består af forskellige celletyper, herunder adipocytter, endotel celler, fibroblaster og immunceller. Under progression af fedme kan ændringer i antallet og aktiviteten af immunceller føre til lav-grade betændelse af hypertrofisk fedtvæv3,4. Specifikt, det er blevet konstateret, at overdreven energi indtag, ledsaget af kronisk forhøjede niveauer af blodglukose, triglycerider og frie fedtsyrer, fører til adipocyt hypoxi, endoplasmatiske reticulum stress, nedsat mitokondriel funktion og øget cytokinsekretion, hvilket resulterer i aktivering af pro-inflammatoriske fedtvæv immunceller5,6. Tidligere forskning har primært fokuseret på medfødt immunitet, men mere nyligt adaptive immunceller (T og B celler) er dukket op som vigtige regulatorer af glukose homøostase. De besidder inflammatoriske (herunder CD8+ T-celler, Th1 og B-celler) eller primært regulerende funktioner (herunder regulatoriske T (treg) celler, Th2 celler) og kan både forværre eller beskytte mod insulinresistens7,8 , 9. det er
Desuden blev der foreslået flere mekanismer til at forklare, hvordan fedme øger steatohepatitis, herunder øget produktion af cytokiner ved fedtvæv10. NASH, den progressive form af ikke-alkoholiske fedt leversygdom og en stor sundhedsbyrde i de udviklede lande, er histologisk karakteriseret ved ballooned hepatocytter, lipid akkumulering, fibrose og pericellulær inflammation og kan udvikle sig til leversygdom i slutstadiet eller hepatocellulær karcinom. Flere regime (for eksempel methionin og cholin mangelfuld kost11) er kendt for at INDUCERE Nash-lignende lever patologi i ikke-humane dyremodeller, men de fleste af disse tilgange ikke rekapitulate menneskelige betingelser for Nash og dens metaboliske konsekvenser, da de enten kræver specifikke gen knockout, ikke-fysiologiske kost manipulationer eller manglende insulinresistens typisk for menneskelige NASH. Desuden er vores forståelse af de underliggende mekanismer for metaboliske sygdomme i øjeblikket baseret på eksperimenter udført med laboratorie mus, der er anbragt under standard specifikke patogenfri (SPF) betingelser. Disse barriere faciliteter er unormalt hygiejniske og ikke anser den mikrobielle mangfoldighed mennesker har at støde på, som kan tage højde for vanskeligheder i oversættelsen processen af dyreforsøg til kliniske tilgange12,13 , 14. det er
For at undersøge de forskellige immuncelle undersæt i fedtvæv og leveren under udviklingen af insulinresistens og NASH i en avanceret musemodel, der gengiver humane immunologiske tilstande, blev mus anbragt i individuelle bure i semi sterile betingelser uden barriere. Mus opstaldet under antigen udsatte forhold udviklede NASH-lignende lever patologi allerede efter 15 ugers højt fedtfattig kost (HFD) fodring13. Sammenlignet med alders matchede SPF-mus udviklede de makrovesikulær steatose, hepatisk infiltration og aktivering af immunceller.
Dette manuskript beskriver en robust flow cytometri analyse til at definere og tælle immuncelle undersæt fra mus fedtvæv og leveren i en model af NASH. Flow cytometri analyse giver mulighed for påvisning af flere parametre af individuelle celler samtidig i modsætning til RT-PCR eller Immunhistokemi tilgange.
Sammenfattende, vores undersøgelse tilbyder en mus model af kortsigtede HFD for at undersøge udviklingen af insulinresistens og NASH og de underliggende mekanismer, der også udviser troskab til den menneskelige tilstand.
Protocol
Representative Results
Discussion
Steatohepatitis har en stærk forbindelse med metaboliske abnormiteter såsom fedme, insulinresistens og dyslipidæmi15. Flere undersøgelser indikerer, at betændelse i fedtvæv kan føre patogenesen af type 2-diabetes, herunder ændrede niveauer af celler i både det medfødte og adaptive immunsystem4,5,16,17 . Desuden, det er blevet konstateret, at fedme moduserer akt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker anke Jurisdich, Diana Woellner, Dr. Kathrin Witte og Cornelia Heckmann for assistance med eksperimentelle procedurer og Benjamin Tiburzy fra Biolegend for at få nyttige kommentarer til gating-strategien. J.S. blev støttet af Helmholtz Grant (ICEMED). Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra den kliniske forskningsenhed under Berlins Institut for sundhed (BIH), “BCRT-Grant” af det tyske Forbundsministerium for uddannelse og forskning og Einstein Foundation. K.S.-B. og H.-D.V. er finansieret af FOR2165.
Materials
| 100µm cell strainers | Falcon | 352340 | |
| 1ml syringe | BD | 309659 | |
| 26G x 5/8 needles | BD | 305115 | |
| 35mm Petri Dishes | Falcon | 353001 | |
| 40µm cell strainers | Falcon | 352340 | |
| ACK lysis buffer | GIBCO | A1049201 | |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45 | Biolegend | 103127 | AB_493714 (BioLegend Cat. No. 103127) |
| Analysis software | FlowJo 10.0.8 software | ||
| APC anti-mouse CD11c Antibody | Biolegend | 117309 | AB_313778 (BioLegend Cat. No. 117309) |
| APC anti-mouse KLRG1 (MAFA) Antibody | Biolegend | 138411 | AB_10645509 (BioLegend Cat. No. 138411) |
| BV421 anti-mouse CD127 Antibody | Biolegend | 135023 | AB_10897948 (BioLegend Cat. No. 135023) |
| BV421 anti-mouse F4/80 Antibody | Biolegend | 123131 | AB_10901171 (BioLegend Cat. No. 123131) |
| BV605 anti-mouse CD279 (PD-1) Antibody | Biolegend | 135219 | AB_11125371 (BioLegend Cat. No. 135219) |
| BV605 anti-mouse NK-1.1 Antibody | Biolegend | 108739 | AB_2562273 (BioLegend Cat. No. 108739) |
| BV650 anti-mouse/human CD11b Antibody | Biolegend | 101239 | AB_11125575 (BioLegend Cat. No. 101239) |
| BV711 anti-mouse/human B220 Antibody | Biolegend | 103255 | AB_2563491 (BioLegend Cat. No. 103255) |
| BV785 anti-mouse CD8a Antibody | Biolegend | 100749 | AB_11218801 (BioLegend Cat. No. 100749) |
| C57Bl/6J mice, male, 5 weeks old | Forschungseinrichtungen für experimentelle Medizin (FEM) | ||
| CaCl2 | Charité – Universitätsmedizin Berlin | A119.1 | |
| Collagenase NB 4G Proved Grade | SERVA | 11427513 | |
| Collagenase Typ I | Worthington | LS004197 | |
| Conical centrifuge tube 15ml | Falcon | 352096 | |
| Conical centrifuge tube 50ml | Falcon | 352070 | |
| DNAse | Sigma-Aldrich | 4716728001 | |
| Fetal bovine serum | Biochrom | S0115 | |
| Filter 30µm | Celltrics | 400422316 | |
| FITC anti-mouse CD3 Antibody | Biolegend | 100203 | AB_312660 (BioLegend Cat. No. 100203) |
| Flow cytometry | BD-LSR Fortessa | ||
| Forceps | Sigma-Aldrich | F4142-1EA | |
| HBSS | Bioanalytic GmBH | 085021-0500 | |
| High-fat diet | SSNIF | E15741–34 | 60 kJ% from fat, 19 kJ% from proteins, and 21 kJ% from carbohydrates |
| micro dissecting scissors | Sigma-Aldrich | S3146 | used for dissection purposes |
| PE anti-mouse CD25 Antibody | Biolegend | 101903 | AB_312846 (BioLegend Cat. No. 101903) |
| PE/Cy7 anti-mouse CD62L Antibody | Biolegend | 104417 | AB_313102 (BioLegend Cat. No. 104417) |
| PE/Cy7 anti-mouse I-A/I-E (MHCII) Antibody | Biolegend | 107629 | AB_2290801 (BioLegend Cat. No. 107629) |
| PE/Dazzle 594 anti-mouse CD4 Antibody | Biolegend | 100565 | AB_2563684 (BioLegend Cat. No. 100565) |
| Percoll solution | Biochrom | L6115 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD44 Antibody | Biolegend | 103031 | AB_2076206 (BioLegend Cat. No. 103031) |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse Gr-1 Antibody | Biolegend | 108427 | AB_893561 (BioLegend Cat. No. 108427) |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 12559069 | |
| Round-Bottom Tubes with cell strainer cap | STEMCELL Technologies | 38030 | |
| TruStain fcX anti-mouse CD16/32 | Biolegend | 101301 | AB_312800 (BioLegend Cat. No. 101301) |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T6146 | |
| Zombie NIR Fixable Viability Kit | Biolegend | 423105 | viablity stain |
References
- Guh, D. P., et al. The incidence of co-morbidities related to obesity and overweight: A systematic review and meta-analysis. BMC Public Health. 9, 88 (2009).
- Prentki, M. Islet β cell failure in type. J Clin Invest. 116 (7), 1802-1812 (2006).
- Shoelson, S. E., Lee, J., Goldfine, A. B. Inflammation and insulin resistance. Journal of Clinical Investigation. 116 (7), 1793-1801 (2006).
- Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444, 840 (2006).
- Exley, M. A., Hand, L., O’Shea, D., Lynch, L. Interplay between the immune system and adipose tissue in obesity. Journal of Endocrinology. 223 (2), R41-R48 (2014).
- Ferrante, A. W. Macrophages, fat, and the emergence of immunometabolism. Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 4992-4993 (2013).
- Winer, D. A., et al. B cells promote insulin resistance through modulation of T cells and production of pathogenic IgG antibodies. Nature Medicine. 17, 610 (2011).
- Onodera, T., et al. Adipose tissue macrophages induce PPARγ-high FOXP3(+) regulatory T cells. Scientific Reports. 5, (2015).
- Lackey, D. E., Olefsky, J. M. Regulation of metabolism by the innate immune system. Nature Reviews Endocrinology. 12, 15 (2015).
- Calle, E. E., Kaaks, R. Overweight, obesity and cancer: epidemiological evidence and proposed mechanisms. Nature Reviews Cancer. 4, 579 (2004).
- Ibrahim, S. H., Hirsova, P., Malhi, H., Gores, G. J. Animal Models of Nonalcoholic Steatohepatitis: Eat, Delete, and Inflame. Digestive Diseases and Sciences. 61 (5), 1325-1336 (2016).
- Beura, L. K., et al. Recapitulating adult human immune traits in laboratory mice by normalizing environment. Nature. 532 (7600), 512-516 (2016).
- Sbierski-Kind, J., et al. Distinct Housing Conditions Reveal a Major Impact of Adaptive Immunity on the Course of Obesity-Induced Type 2 Diabetes. Frontiers in Immunology. 9 (1069), (2018).
- Japp, A. S., et al. Wild immunology assessed by multidimensional mass cytometry. Cytometry Part A. 91 (1), 85-95 (2017).
- Benedict, M., Zhang, X. Non-alcoholic fatty liver disease: An expanded review. World Journal of Hepatology. 9 (16), 715-732 (2017).
- McNelis, J. C., Olefsky, J. M. Macrophages, Immunity, and Metabolic Disease. Immunity. 41 (1), 36-48 (2014).
- Ferrante, A. W. The Immune Cells in Adipose Tissue. Diabetes, Obesity & Metabolism. 15, 34-38 (2013).
- Bertola, A., et al. Hepatic expression patterns of inflammatory and immune response genes associated with obesity and NASH in morbidly obese patients. PloS One. 5 (10), e13577 (2010).
- Turnbaugh, P. J., Bäckhed, F., Fulton, L., Gordon, J. I. Diet-Induced Obesity Is Linked to Marked but Reversible Alterations in the Mouse Distal Gut Microbiome. Cell Host & Microbe. 3 (4), 213-223 (2008).
- Singh, R. K., et al. Influence of diet on the gut microbiome and implications for human health. Journal of Translational Medicine. 15 (1), 73 (2017).
- Müller, V. M., et al. Gut barrier impairment by high-fat diet in mice depends on housing conditions. Molecular Nutrition & Food Research. 60 (4), 897-908 (2016).
