הפעלה כימית של ה-E3 אוביקוויב Ligase הומו מבוסס על ידי Pomalidomide מבוססי ההומו-פרוטואקס
Summary
עבודה זו מתארת את הסינתזה והאפיון של המבוסס על המוח, bifunctional הומו-protac כגישה הרומן כדי לגרום אובילינציה והשפלה של E3 אוביקוויב ליגאז המוח (crbn), המטרה של תלידומיד אנלוגיים gs.
Abstract
התרופות האימונומודולטוריים (שפוניים) תלידומיד ו האנלוגית שלה, lenalidomide ו pomalidomide, כל ה-FDA אישר תרופות לטיפול מיאלומה נפוצה, לגרום אוביקווינציה והשפלה של שעתוק הלימפה הגורמים אימוס (IKZF1) ו aiolos (IKZF3) באמצעות המוח (crbn) E3 אוביקוויב ליגאז עבור השפלה פרוטאספאואל. הסרדים לאחרונה כבר נוצל עבור הדור של bifunctional פרוטפוליזיס מיקוד הצ (PROTACs) כדי למקד חלבונים אחרים עבור אוביקווינציה ו השפלה פרוטאספאל על ידי CRBN E3 ligase. עיצבנו ו מסונתז pomalidomide מבוססי מבוסס PROTACs וניתח את היכולת שלהם כדי לגרום לעצמי אוביקווינציה והשפלה של CRBN. כאן, crbn משמש שניהם, the E3 אוביקוויב ליגאז ואת המטרה באותו זמן. מתחם הומו-פרוטואק 8 מאשר crbn עם עוצמה גבוהה עם השפעות שנותרו מינימליות בלבד על IKZF1 ו IKZF3. Crbn איון פעלה על ידי מתחם 8 לא היתה השפעה על הכדאיות התא והתפשטות של שונים תאים מיאלומה נפוצה. זה הומו-PROTAC abrogates ההשפעות של שפתוכים בתאי מיאלומה נפוצה. לכן, תרכובות מבוססות שלנו pomalidomide שלנו עשוי לסייע לזהות מצעים האנדוגניים של CRBN ופונקציות פיזיולוגיות ולחקור את המנגנון המולקולרי של הפתוכים.
Introduction
התרופות האימונומודולטוריים (שפתוכים) תלידומיד ו האנלוגית שלה, lenalidomide ו pomalidomide, כל מאושר לטיפול מיאלומה נפוצה, לאגד את המידע e3 אוביקוויב ליגאז (crbn), מתאם מצע עבור cullin4A-RING e3 לליגאז (CRL4crbn)1,2,3. איגוד של הסרדים מגביר את האהדה של CRL4crbn כדי שעתוק הלימפה גורמים אינוס (IKZF1) ו aiolos (IKZF3), המוביל שלהם אוביגינציה והשפלה (איור 1)4,5, מיכל בן 6 , מיכל סבן , 8. מאז IKZF1 ו IKZF3 חיוניים עבור תאים מיאלומה נפוצה, תוצאות חוסר ההפעלה שלהם מעכבות גדילה. SALL4 נמצאה לאחרונה כמו הגנום הניאו המושרה נוסף של crbn כי הוא כנראה אחראי על טראטוגניזה ואת האסון contergan בשנות החמישים שנגרמו על ידי תלידומיד9,10. לעומת זאת, שהקזאין (CK1α) הוא מצע מיוחד של CRBN, שהוא מעורב באפקט הטיפולי בתסמונת המיאלודיספלסטית עם מחיקות 5q של כרומוזום11.
היכולת של מולקולות קטנות למקד חלבון מסוים להשפלה היא רמז מרגש להתפתחות הסמים המודרנית. בעוד המנגנון של תלידומיד ואת האנלוגיות שלה התגלתה לאחר השימוש הראשון שלהם בבני אדם, כך קרא Proteolysis Targeting Chimeras (protacs) תוכננו במיוחד למקד חלבון של עניין (הדמות) (איור 2)12,13,14,15,16,17,18. Protacs הם מולקולות הטרובייוטיות המורכבות של ליגנד עבור פוי מחובר באמצעות מקשר ל ליגו של E3 אוביקוויב ליגאז כמו crbn or פון-היפרפל-ינדאו (vhl)18,19,20, 21,22. PROTACs לגרום להיווצרות של מתחם טרנארי חולף, הנחיית פוי ל-E3 אוביקוויב ligase, וכתוצאה מכך אוביקווינציה שלה והשפלה פרוטאספאואל. היתרונות העיקריים של PROTACs על פני מעכבי קונבנציונלי היא כי קשירה של פוי הוא מספיק ולא העכבות שלה ולכן PROTACs יכול למקד ספקטרום רחב הרבה יותר של חלבונים כולל אלה שנחשבו להיות undruggable כמו גורמים שעתוק15. בנוסף, מולקולות צ’יאריק לפעול באופן מזרז ולכן יש עוצמה גבוהה. לאחר העברת אוביקוויב לנקודת ההפוי, הקומפלקס הטרארי מנתק וזמין להיווצרות מתחמים חדשים. כך, ריכוזי PROTAC נמוך מאוד מספיקים עבור השפלה של חלבון היעד23.
כאן אנו מתארים את הסינתזה של pomalidomide-פוליאנide הומו-PROTAC (מתחם 8) כי המגוייסים עבור השפלה של עצמו24. The E3 אוביקוויט ליגאז crbn משמש הן המגייס ואת המטרה באותו זמן (איור 3). כדי לאמת את הנתונים שלנו, מסונתז גם בקרת מחייב שלילי (מתחם 9). הנתונים שלנו לוודא כי מסונתז הומו-PROTAC החדש הוא ספציפי עבור השפלה CRBN ויש לו רק השפעות מינימליות על חלבונים אחרים.
Protocol
Representative Results
Discussion
העיצוב של כזה הומו-PROTACs כפי שתואר כאן עבור CRBN מסתמך על הזיקה הספציפית של pomalidomide כדי CRBN, אשר כבר נוצל בהצלחה ברבים הטרובידותיום PROTACs והביא לפיתוח PROTACS 8 כמו מאוד CRBN degrader סלקטיבית. הספציפיות של המולקולה שלנו כבר אושרה על-ידי ניתוחים פרוטאואריים24. עבור הסתרה מתווכת גנטית, ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו היתה נתמכת על ידי הגרמני של הפרויקט (אמי-נתר התוכנית Kr-3886/2-1 ו-SFB-1074 לג; FOR2372 to מ)
Materials
| 1,1'-Carbonyldiimidazole | TCI chemicals | C0119 | |
| 2,2′-(Ethylenedioxy)-bis(ethylamine) | Sigma-Aldrich | 385506 | Compound 6 |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 3-Fluorophthalic anhydride, 98 % | Alfa Aesar | A12275 | |
| 4-Dimethylaminopyridine, 99 % | Acros | 148270250 | Toxic |
| Acrylamidstammlösung/ Bisacrylamid (30%/0,8%) | Carl Roth | 3029.1 | |
| Aiolos (D1C1E) mAB | Cell signaling | 15103S | |
| Anti-CRBN antibody produced in rabbit | Sigma | HPA045910 | |
| Anti-rabbit IgG HRP-linked antibody | Sigma | 7074S | |
| Ammonium Persulfate | Roth | 9592.2 | |
| Boc-Gln-OH | TCI chemicals | B1649 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100G | |
| CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7571 | |
| ChemiDoc XRS+ | Bio-Rad | 1708265 | |
| DMF, anhydrous, 99.8 % | Acros | 348435000 | Extra Dry over Molecular Sieve |
| DMSO, anhydrous, 99.7 % | Acros | 348445000 | Extra Dry over Molecular Sieve |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 15523-1L-R | |
| Goat anti-mouse (HRP conjugated) | Santa Cruz biotechnology | sc-2005 | |
| Halt Protease & Phosphatase Inhibitor Single-use Cocktail (100X) | Thermo Scientific | 1861280 | |
| Ikaros (D6N9Y) Mab | Cell signaling | 14859S | |
| ImmobilonP Transfer Membrane (0,45µm) | Merck | IPVH000010 | |
| Iodomethane, 99 % | Sigma-Aldrich | I8507 | Highly toxic |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 32213-2.5L | |
| Mg132 | Selleckchem | S2619 | |
| Mini Trans-Blot electrophoretic transfer cell | Bio-Rad | 1703930 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 1658004 | |
| MLN4942 | biomol (cayman) | Cay15217-1 | |
| Monoclonal Anti-α-Tubulin antibody produced in mouse (B512) | Sigma | T5168 | |
| N-Ethyldiisopropylamine, 99 % | Alfa Aesar | A11801 | |
| Nonfat dried milk powder | PanReac AppliChem | A0830,0500 | |
| Nunc F96 MicroWell White Polystyrene Plate | Thermo Scientific | 136101 | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | Thermo Scientific | NP0008 | |
| Pierce BCA Protein Assay kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Pomalidomide | Selleckchem | S1567 | |
| RestoreTM Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientific | 46430 | |
| sodium dodecyl sulfate | Carl Roth | 183.1 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | A9539-500g | |
| TEMED | Carl Roth | 2367.3 | |
| tert-Butyl N-[2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl]carbamate | Sigma-Aldrich | 89761 | Compound 5 |
| Tricin | Carl Roth | 6977.4 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503-1kg | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949-500ml | |
| WesternBright ECL spray | Advansta | K-12049-D50 |
References
- Ito, T., et al. Identification of a primary target of thalidomide teratogenicity. Science. 327 (5971), 1345-1350 (2010).
- Lopez-Girona, A., et al. Cereblon is a direct protein target for immunomodulatory and antiproliferative activities of lenalidomide and pomalidomide. Leukemia. 26 (11), 2326-2335 (2012).
- Fischer, E. S., et al. Structure of the DDB1-CRBN E3 ubiquitin ligase in complex with thalidomide. Nature. 512 (7512), 49-53 (2014).
- Gandhi, A. K., et al. Immunomodulatory agents lenalidomide and pomalidomide co-stimulate T cells by inducing degradation of T cell repressors Ikaros and Aiolos via modulation of the E3 ubiquitin ligase complex CRL4(CRBN). British Journal of Haematology. 164 (6), 811-821 (2014).
- Kronke, J., Hurst, S. N., Ebert, B. L. Lenalidomide induces degradation of IKZF1 and IKZF3. Oncoimmunology. 3 (7), e941742 (2014).
- Lu, G., et al. The myeloma drug lenalidomide promotes the cereblon-dependent destruction of Ikaros proteins. Science. 343 (6168), 305-309 (2014).
- Zhu, Y. X., Kortuem, K. M., Stewart, A. K. Molecular mechanism of action of immune-modulatory drugs thalidomide, lenalidomide and pomalidomide in multiple myeloma. Leukemia & Lymphona. 54 (4), 683-687 (2013).
- Chamberlain, P. P., et al. Structure of the human Cereblon-DDB1-lenalidomide complex reveals basis for responsiveness to thalidomide analogs. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (9), 803-809 (2014).
- Donovan, K. A., et al. Thalidomide promotes degradation of SALL4, a transcription factor implicated in Duane Radial Ray syndrome. eLife. 7, (2018).
- Matyskiela, M. E., et al. SALL4 mediates teratogenicity as a thalidomide-dependent cereblon substrate. Nature Chemical Biology. 14 (10), 981-987 (2018).
- Kronke, J., et al. Lenalidomide induces ubiquitination and degradation of CK1alpha in del(5q) MDS. Nature. 523 (7559), 183-188 (2015).
- Sakamoto, K. M., et al. Protacs: chimeric molecules that target proteins to the Skp1-Cullin-F box complex for ubiquitination and degradation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (15), 8554-8559 (2001).
- Sakamoto, K. M., et al. Development of Protacs to target cancer-promoting proteins for ubiquitination and degradation. Molecular & Cellular Proteomics. 2 (12), 1350-1358 (2003).
- Schneekloth, J. S., et al. Chemical genetic control of protein levels: selective in vivo targeted degradation. Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3748-3754 (2004).
- Gu, S., Cui, D., Chen, X., Xiong, X., Zhao, Y. PROTACs: An Emerging Targeting Technique for Protein Degradation in Drug Discovery. Bioessays. 40 (4), e1700247 (2018).
- Collins, I., Wang, H., Caldwell, J. J., Chopra, R. Chemical approaches to targeted protein degradation through modulation of the ubiquitin-proteasome pathway. Biochemical Journal. 474 (7), 1127-1147 (2017).
- Neklesa, T. K., Winkler, J. D., Crews, C. M. Targeted protein degradation by PROTACs. Pharmacology & Therapeutics. 174, 138-144 (2017).
- Winter, G. E., et al. Phthalimide conjugation as a strategy for in vivo target protein degradation. Science. 348 (6241), 1376-1381 (2015).
- Maniaci, C., et al. Homo-PROTACs: bivalent small-molecule dimerizers of the VHL E3 ubiquitin ligase to induce self-degradation. Nature Communications. 8 (1), 830 (2017).
- Crew, A. P., et al. Identification and Characterization of Von Hippel-Lindau-Recruiting Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of TANK-Binding Kinase 1. Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).
- Lu, J., et al. Hijacking the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon to Efficiently Target BRD4. Chemistry & Biology. 22 (6), 755-763 (2015).
- Steinebach, C., et al. PROTAC-mediated crosstalk between E3 ligases. Chemical Communications. 55 (12), 1821-1824 (2019).
- Tinworth, C. P., Lithgow, H., Churcher, I. Small molecule-mediated protein knockdown as a new approach to drug discovery. Medchemcomm. 7 (12), 2206-2216 (2016).
- Steinebach, C., et al. Homo-PROTACs for the Chemical Knockdown of Cereblon. ACS Chemical Biology. 13 (9), 2771-2782 (2018).
- Ambrozak, A., et al. Synthesis and Antiangiogenic Properties of Tetrafluorophthalimido and Tetrafluorobenzamido Barbituric Acids. ChemMedChem. 11 (23), 2621-2629 (2016).
- Zhou, B., et al. Discovery of a Small-Molecule Degrader of Bromodomain and Extra-Terminal (BET) Proteins with Picomolar Cellular Potencies and Capable of Achieving Tumor Regression. Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).
- Zhang, C., et al. Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK). European Journal of Medicinal Chemistry. 151, 304-314 (2018).
- Runcie, A. C., Chan, K. H., Zengerle, M., Ciulli, A. Chemical genetics approaches for selective intervention in epigenetics. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 186-194 (2016).
- Kronke, J., et al. Lenalidomide causes selective degradation of IKZF1 and IKZF3 in multiple myeloma cells. Science. 343 (6168), 301-305 (2014).
- Eichner, R., et al. Immunomodulatory drugs disrupt the cereblon-CD147-MCT1 axis to exert antitumor activity and teratogenicity. Nature Medicine. 22 (7), 735-743 (2016).
- Zhu, Y. X., et al. Cereblon expression is required for the antimyeloma activity of lenalidomide and pomalidomide. Blood. 118 (18), 4771-4779 (2011).
- Kortum, K. M., et al. Targeted sequencing of refractory myeloma reveals a high incidence of mutations in CRBN and Ras pathway genes. Blood. 128 (9), 1226-1233 (2016).
- Gil, M., et al. Cereblon deficiency confers resistance against polymicrobial sepsis by the activation of AMP activated protein kinase and heme-oxygenase-1. Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 976-981 (2018).
- Kim, H. K., et al. Cereblon in health and disease. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 468 (8), 1299-1309 (2016).
- Lee, K. M., et al. Disruption of the cereblon gene enhances hepatic AMPK activity and prevents high-fat diet-induced obesity and insulin resistance in mice. Diabetes. 62 (6), 1855-1864 (2013).
