Химическая инактивация E3 Ubiquitin Ligase Cereblon по помалидомидной основе Homo-PROTACs
Summary
Эта работа описывает синтез и характеристику помалидомида основе, бифункциональный гомо-PROTAC как новый подход, чтобы вызвать убиквитинирование и деградацию E3 убиквитин лигазе цереблон (CRBN), цель аналогов талидомида.
Abstract
Иммуномодулирующие препараты (IMiDs) талидомид и его аналоги, леналидомид и помалидомид, все одобренные FDA препараты для лечения множественной миеломы, вызывают униквитивание и деградацию лимфоидных транскрипционных факторов Ikaros (IK-F1) и Aiolos (IK-F3) через цереблон (CRBN) E3 убиквитин лигаза для протеасомальной деградации. IMIDs недавно были использованы для генерации бифункционального протеолиза ориентации химер (PROTACs) для целевой других белков для убликвитина и протеасомальной деградации CRBN E3 лигазы. Мы разработали и синтезировали помалидомидна основе гомобифункциональных PROTACs и проанализировали их способность вызывать самостоятельной повсеместности и деградации CRBN. Здесь, CRBN служит как, E3 убиквитин лигаза и цель в то же время. Соединение гомо-ПРОТАК 8 ухудшает CRBN с высокой потенцией с минимальным оставшимся воздействием на Ik-F1 и IK-F3. Инактивация CRBN соединением 8 не оказала влияния на жизнеспособность клеток и пролиферацию различных линий клеток миеломы. Это гомо-PROTAC отменяет эффекты ИМИД в нескольких клетках миеломы. Таким образом, наши гомодимерные соединения на основе помалидомида могут помочь определить эндогенные субстраты и физиологические функции CRBN и исследовать молекулярный механизм ИМИД.
Introduction
Иммуномодулирующие препараты (IMiDs) талидомид и его аналоги, леналидомид и помалидомид, все одобренные для лечения множественной миеломы, связываются с E3 ubiquitin ligase cereblon (CRBN), субстратным адаптером для cullin4A-RING E3 ubiquitin ligase (CRL4CRBN)1,2,3. Связывание ИМиД повышает сродство CRL4CRBN к лимфоидным транскрипционным факторам Ikaros (IK-F1) и Айолосу (Ik-F3), что приводит к их увсеквитизации и деградации(рисунок 1)4,5, 6 , 7 (г. , 8. В виду того что IK-F1 и IK-F3 необходимы для множественных клеток миеломы, их инактивация приводит к ингибированию роста. SALL4 был недавно найден в качестве дополнительного IMiD-индуцированного нео-субстрата CRBN, который, вероятно, несет ответственность за тератогенность и так называемую катастрофу Контерган в 1950-х годов, вызванных талидомид9,10. В отличие от этого, казеин киназы 1 “(CK1” является леналидомид-специфический субстрат CRBN, который вовлечен в терапевтический эффект в миелодиспластический синдром с хромосомой 5q делети11.
Способность малых молекул ориентироваться на конкретный белок для деградации является захватывающим следствием для современного развития лекарств. В то время как механизм талидомида и его аналогов был обнаружен после их первого использования в организме человека, так называемый Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) были разработаны специально для целевой белок, представляющий интерес (POI) (Рисунок 2)12,13,14,15,16,17,18. PROTACs являются гетеробифункциональные молекулы, которые состоят из конкретного лиганд для POI подключен через ссылку на лиганд E3 убиквитин лигаза, как CRBN или фон-Гиппель-Линдау (VHL)18,19,20, 21,22. PROTACs индуцировать формирование переходного тернари комплекса, направляя POI к E3 убиквитин лигаза, в результате его повсеместности и протеасомальной деградации. Основные преимущества PROTACs по сравнению с обычными ингибиторами заключается в том, что связывание с POI является достаточным, а не его ингибирование и, следовательно, PROTACs потенциально может целевой гораздо более широкий спектр белков, включая те, которые считались неприсменяемыми, как транскрипции факторы15. Кроме того, химерные молекулы действуют каталитически и поэтому обладают высокой потенцией. После переноса убиквитина в POI, тернарийкомплекс отделяется и доступен для формирования новых комплексов. Таким образом, очень низких концентраций PROTAC достаточно для деградации целевого белка23.
Здесь мы описываем синтез pomalidomide-pomalidomide конъюгированный гомо-PROTAC (соединение 8), который набирает CRBN для деградации себя24. E3 ubiquitin ligase CRBN служит как вербовщики и цели в то же время (Рисунок 3). Для проверки наших данных мы также синтезировали отрицательный связывающий контроль (соединение 9). Наши данные подтверждают, что недавно синтезированный homo-PROTAC специфичен для деградации CRBN и оказывает лишь минимальное воздействие на другие белки.
Protocol
Representative Results
Discussion
Конструкция таких гомо-ПРОТАК, описанных здесь для CRBN, опирается на специфическую близость помалидомда к CRBN, которая успешно используется в многочисленных гетеробифункциональных ПРОТАКи и привела к развитию PROTAC 8 как высоко селективный деградер CRBN. Специфика нашей молекулы у…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Deutsche Forschungsgemeinschaft (Программа Эмми-Ноэтер Kr-3886/2-1 и SFB-1074 в J.K.; FOR2372 до M.G.)
Materials
| 1,1'-Carbonyldiimidazole | TCI chemicals | C0119 | |
| 2,2′-(Ethylenedioxy)-bis(ethylamine) | Sigma-Aldrich | 385506 | Compound 6 |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 3-Fluorophthalic anhydride, 98 % | Alfa Aesar | A12275 | |
| 4-Dimethylaminopyridine, 99 % | Acros | 148270250 | Toxic |
| Acrylamidstammlösung/ Bisacrylamid (30%/0,8%) | Carl Roth | 3029.1 | |
| Aiolos (D1C1E) mAB | Cell signaling | 15103S | |
| Anti-CRBN antibody produced in rabbit | Sigma | HPA045910 | |
| Anti-rabbit IgG HRP-linked antibody | Sigma | 7074S | |
| Ammonium Persulfate | Roth | 9592.2 | |
| Boc-Gln-OH | TCI chemicals | B1649 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100G | |
| CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7571 | |
| ChemiDoc XRS+ | Bio-Rad | 1708265 | |
| DMF, anhydrous, 99.8 % | Acros | 348435000 | Extra Dry over Molecular Sieve |
| DMSO, anhydrous, 99.7 % | Acros | 348445000 | Extra Dry over Molecular Sieve |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 15523-1L-R | |
| Goat anti-mouse (HRP conjugated) | Santa Cruz biotechnology | sc-2005 | |
| Halt Protease & Phosphatase Inhibitor Single-use Cocktail (100X) | Thermo Scientific | 1861280 | |
| Ikaros (D6N9Y) Mab | Cell signaling | 14859S | |
| ImmobilonP Transfer Membrane (0,45µm) | Merck | IPVH000010 | |
| Iodomethane, 99 % | Sigma-Aldrich | I8507 | Highly toxic |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 32213-2.5L | |
| Mg132 | Selleckchem | S2619 | |
| Mini Trans-Blot electrophoretic transfer cell | Bio-Rad | 1703930 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 1658004 | |
| MLN4942 | biomol (cayman) | Cay15217-1 | |
| Monoclonal Anti-α-Tubulin antibody produced in mouse (B512) | Sigma | T5168 | |
| N-Ethyldiisopropylamine, 99 % | Alfa Aesar | A11801 | |
| Nonfat dried milk powder | PanReac AppliChem | A0830,0500 | |
| Nunc F96 MicroWell White Polystyrene Plate | Thermo Scientific | 136101 | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | Thermo Scientific | NP0008 | |
| Pierce BCA Protein Assay kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Pomalidomide | Selleckchem | S1567 | |
| RestoreTM Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientific | 46430 | |
| sodium dodecyl sulfate | Carl Roth | 183.1 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | A9539-500g | |
| TEMED | Carl Roth | 2367.3 | |
| tert-Butyl N-[2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl]carbamate | Sigma-Aldrich | 89761 | Compound 5 |
| Tricin | Carl Roth | 6977.4 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503-1kg | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949-500ml | |
| WesternBright ECL spray | Advansta | K-12049-D50 |
References
- Ito, T., et al. Identification of a primary target of thalidomide teratogenicity. Science. 327 (5971), 1345-1350 (2010).
- Lopez-Girona, A., et al. Cereblon is a direct protein target for immunomodulatory and antiproliferative activities of lenalidomide and pomalidomide. Leukemia. 26 (11), 2326-2335 (2012).
- Fischer, E. S., et al. Structure of the DDB1-CRBN E3 ubiquitin ligase in complex with thalidomide. Nature. 512 (7512), 49-53 (2014).
- Gandhi, A. K., et al. Immunomodulatory agents lenalidomide and pomalidomide co-stimulate T cells by inducing degradation of T cell repressors Ikaros and Aiolos via modulation of the E3 ubiquitin ligase complex CRL4(CRBN). British Journal of Haematology. 164 (6), 811-821 (2014).
- Kronke, J., Hurst, S. N., Ebert, B. L. Lenalidomide induces degradation of IKZF1 and IKZF3. Oncoimmunology. 3 (7), e941742 (2014).
- Lu, G., et al. The myeloma drug lenalidomide promotes the cereblon-dependent destruction of Ikaros proteins. Science. 343 (6168), 305-309 (2014).
- Zhu, Y. X., Kortuem, K. M., Stewart, A. K. Molecular mechanism of action of immune-modulatory drugs thalidomide, lenalidomide and pomalidomide in multiple myeloma. Leukemia & Lymphona. 54 (4), 683-687 (2013).
- Chamberlain, P. P., et al. Structure of the human Cereblon-DDB1-lenalidomide complex reveals basis for responsiveness to thalidomide analogs. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (9), 803-809 (2014).
- Donovan, K. A., et al. Thalidomide promotes degradation of SALL4, a transcription factor implicated in Duane Radial Ray syndrome. eLife. 7, (2018).
- Matyskiela, M. E., et al. SALL4 mediates teratogenicity as a thalidomide-dependent cereblon substrate. Nature Chemical Biology. 14 (10), 981-987 (2018).
- Kronke, J., et al. Lenalidomide induces ubiquitination and degradation of CK1alpha in del(5q) MDS. Nature. 523 (7559), 183-188 (2015).
- Sakamoto, K. M., et al. Protacs: chimeric molecules that target proteins to the Skp1-Cullin-F box complex for ubiquitination and degradation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (15), 8554-8559 (2001).
- Sakamoto, K. M., et al. Development of Protacs to target cancer-promoting proteins for ubiquitination and degradation. Molecular & Cellular Proteomics. 2 (12), 1350-1358 (2003).
- Schneekloth, J. S., et al. Chemical genetic control of protein levels: selective in vivo targeted degradation. Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3748-3754 (2004).
- Gu, S., Cui, D., Chen, X., Xiong, X., Zhao, Y. PROTACs: An Emerging Targeting Technique for Protein Degradation in Drug Discovery. Bioessays. 40 (4), e1700247 (2018).
- Collins, I., Wang, H., Caldwell, J. J., Chopra, R. Chemical approaches to targeted protein degradation through modulation of the ubiquitin-proteasome pathway. Biochemical Journal. 474 (7), 1127-1147 (2017).
- Neklesa, T. K., Winkler, J. D., Crews, C. M. Targeted protein degradation by PROTACs. Pharmacology & Therapeutics. 174, 138-144 (2017).
- Winter, G. E., et al. Phthalimide conjugation as a strategy for in vivo target protein degradation. Science. 348 (6241), 1376-1381 (2015).
- Maniaci, C., et al. Homo-PROTACs: bivalent small-molecule dimerizers of the VHL E3 ubiquitin ligase to induce self-degradation. Nature Communications. 8 (1), 830 (2017).
- Crew, A. P., et al. Identification and Characterization of Von Hippel-Lindau-Recruiting Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of TANK-Binding Kinase 1. Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).
- Lu, J., et al. Hijacking the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon to Efficiently Target BRD4. Chemistry & Biology. 22 (6), 755-763 (2015).
- Steinebach, C., et al. PROTAC-mediated crosstalk between E3 ligases. Chemical Communications. 55 (12), 1821-1824 (2019).
- Tinworth, C. P., Lithgow, H., Churcher, I. Small molecule-mediated protein knockdown as a new approach to drug discovery. Medchemcomm. 7 (12), 2206-2216 (2016).
- Steinebach, C., et al. Homo-PROTACs for the Chemical Knockdown of Cereblon. ACS Chemical Biology. 13 (9), 2771-2782 (2018).
- Ambrozak, A., et al. Synthesis and Antiangiogenic Properties of Tetrafluorophthalimido and Tetrafluorobenzamido Barbituric Acids. ChemMedChem. 11 (23), 2621-2629 (2016).
- Zhou, B., et al. Discovery of a Small-Molecule Degrader of Bromodomain and Extra-Terminal (BET) Proteins with Picomolar Cellular Potencies and Capable of Achieving Tumor Regression. Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).
- Zhang, C., et al. Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK). European Journal of Medicinal Chemistry. 151, 304-314 (2018).
- Runcie, A. C., Chan, K. H., Zengerle, M., Ciulli, A. Chemical genetics approaches for selective intervention in epigenetics. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 186-194 (2016).
- Kronke, J., et al. Lenalidomide causes selective degradation of IKZF1 and IKZF3 in multiple myeloma cells. Science. 343 (6168), 301-305 (2014).
- Eichner, R., et al. Immunomodulatory drugs disrupt the cereblon-CD147-MCT1 axis to exert antitumor activity and teratogenicity. Nature Medicine. 22 (7), 735-743 (2016).
- Zhu, Y. X., et al. Cereblon expression is required for the antimyeloma activity of lenalidomide and pomalidomide. Blood. 118 (18), 4771-4779 (2011).
- Kortum, K. M., et al. Targeted sequencing of refractory myeloma reveals a high incidence of mutations in CRBN and Ras pathway genes. Blood. 128 (9), 1226-1233 (2016).
- Gil, M., et al. Cereblon deficiency confers resistance against polymicrobial sepsis by the activation of AMP activated protein kinase and heme-oxygenase-1. Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 976-981 (2018).
- Kim, H. K., et al. Cereblon in health and disease. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 468 (8), 1299-1309 (2016).
- Lee, K. M., et al. Disruption of the cereblon gene enhances hepatic AMPK activity and prevents high-fat diet-induced obesity and insulin resistance in mice. Diabetes. 62 (6), 1855-1864 (2013).
