Inactivación química del E3 Ubiquitin Ligase Cereblon por Homo-PROTACs basados en Pomalidomida
Summary
Este trabajo describe la síntesis y caracterización de un homo-PROTAC bifuncional basado en pomalidomida como un enfoque novedoso para inducir la ubiquitinación y degradación de la e3 ubiquitina ligreblon (CRBN), el objetivo de los análogos de la talidomida.
Abstract
La talidomida de los fármacos inmunomoduladores (IMID) y sus análogos, lenalidomida y pomalidomida, todos los medicamentos aprobados por la FDA para el tratamiento del mieloma múltiple, inducen ubiquitinación y degradación de los factores de transcripción linfoide Ikaros (IKZF1) y Aiolos (IKZF3) a través de la ligasa de ubiquitina cereblon (CRBN) E3 para la degradación proteasomal. Los IMID se han utilizado recientemente para la generación de proteólisis bifuncional dirigida a quimeras (PROTAC) para apuntar a otras proteínas para la ubiquitinación y la degradación proteasomal por la ligasa CRBN E3. Diseñamos y sintetizamos PROTACfuncionales basados en pomalidomida y analizamos su capacidad para inducir la ubiquitinación autodirigida y la degradación de CRBN. Aquí, CRBN sirve como ambos, la ligada a la ubiquitina E3 y el objetivo al mismo tiempo. El compuesto homo-PROTAC 8 degrada CRBN con una alta potencia con sólo efectos restantes mínimos sobre IKZF1 e IKZF3. La inactivación de CRBN por compuesto 8 no tuvo ningún efecto sobre la viabilidad celular y la proliferación de diferentes líneas celulares de mieloma múltiple. Este homo-PROTAC deroga los efectos de los ID En múltiples células de mieloma. Por lo tanto, nuestros compuestos homodíricos a base de pomalidomida pueden ayudar a identificar los sustratos endógenos y las funciones fisiológicas de CRBN e investigar el mecanismo molecular de los IMID.
Introduction
La litimida de los fármacos inmunomoduladores (IID) y sus análogos, lenalidomida y pomalidomida, todos aprobados para el tratamiento del mieloma múltiple, se unen a la e3 ubiquitina ligreblon (CRBN), un adaptador de sustrato para cullin4A-RING E3 ubiquitina ligerina (CRL4CRBN)1,2,3. La unión de los IMID mejora la afinidad de CRL4CRBN con los factores de transcripción linfoide Ikaros (IKZF1) y Aiolos (IKZF3), lo que lleva a su ubiquitinación y degradación (Figura1)4,5, 6 , 7 , 8. Dado que IKZF1 e IKZF3 son esenciales para múltiples células de mieloma, sus resultados de inactivación en la inhibición del crecimiento. SALL4 fue encontrado recientemente como un neo-sustrato adicional inducido por el IMiD de CRBN que es probablemente responsable de la teratogenicidad y la llamada catástrofe de Contergan en la década de 1950 causada por talidomida9,10. Por el contrario, la caseína quinasa 1o (CK1o) es un sustrato específico de lenalidomida de CRBN que está implicado en el efecto terapéutico en el síndrome mielodisplásico con deleciones del cromosoma 5q11.
La capacidad de las moléculas pequeñas para apuntar a una proteína específica para la degradación es una implicación emocionante para el desarrollo de fármacos modernos. Mientras que el mecanismo de talidomida y sus análogos fue descubierto después de su primer uso en humanos, los llamados Proteólisis Targeting Chimeras (PROTACs) han sido diseñados para apuntar específicamente a una proteína de interés (POI) (Figura 2)12,13,14,15,16,17,18. Los PROTACACs son moléculas heterobifuncionales que consisten en un ligando específico para el PDI conectado a través de un vinculador a un ligando de una ligasa de ubiquitina E3 como CRBN o von-Hippel-Lindau (VHL)18,19,20, 21,22. Los PROTAC inducen la formación de un complejo ternario transitorio, dirigiendo el PDI a la ligasa de ubiquitina E3, lo que resulta en su ubiquitinación y degradación proteasomal. Las principales ventajas de los PROTAC sobre los inhibidores convencionales es que la unión a un PDI es suficiente en lugar de su inhibición y, por lo tanto, los PROTAC pueden potencialmente apuntar a un espectro mucho más amplio de proteínas, incluidas las que se consideraron ingodibles como factores de transcripción15. Además, las moléculas quiméricas actúan catalíticamente y por lo tanto tienen una alta potencia. Después de la transferencia de ubiquitina al PDI, el complejo ternario se disocia y está disponible para la formación de nuevos complejos. Por lo tanto, las concentraciones muy bajas de PROTAC son suficientes para la degradación de la proteína diana23.
Aquí describimos la síntesis de un homo-PROTAC conjugado conjugado pomalidomida-pomalidomida (compuesto 8)que recluta CRBN para la degradación de sí mismo24. El CRBN de la ligasa de ubiquitina E3 sirve como reclutador y objetivo al mismo tiempo (Figura3). Para validar nuestros datos, también sintetizamos un control de enlace negativo (compuesto 9). Nuestros datos confirman que el homo-PROTAC recién sintetizado es específico para la degradación de CRBN y sólo tiene efectos mínimos en otras proteínas.
Protocol
Representative Results
Discussion
El diseño de tales homo-PROTAC como se describe aquí para CRBN se basa en la afinidad específica de la pomalidomida con CRBN, que se ha utilizado con éxito en numerosos PROTAC heterobifuncionales y dio lugar al desarrollo de PROTAC 8 como un altamente degradador selectivo de CRBN. La especificidad de nuestra molécula ya ha sido confirmada por los análisis proteómicos24. Para el knockout genéticamente mediado, la exclusión y validación de los efectos secundarios es difíc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (Emmy-Noether Program Kr-3886/2-1 y SFB-1074 a J.K.; FOR2372 a M.G.)
Materials
| 1,1'-Carbonyldiimidazole | TCI chemicals | C0119 | |
| 2,2′-(Ethylenedioxy)-bis(ethylamine) | Sigma-Aldrich | 385506 | Compound 6 |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 3-Fluorophthalic anhydride, 98 % | Alfa Aesar | A12275 | |
| 4-Dimethylaminopyridine, 99 % | Acros | 148270250 | Toxic |
| Acrylamidstammlösung/ Bisacrylamid (30%/0,8%) | Carl Roth | 3029.1 | |
| Aiolos (D1C1E) mAB | Cell signaling | 15103S | |
| Anti-CRBN antibody produced in rabbit | Sigma | HPA045910 | |
| Anti-rabbit IgG HRP-linked antibody | Sigma | 7074S | |
| Ammonium Persulfate | Roth | 9592.2 | |
| Boc-Gln-OH | TCI chemicals | B1649 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100G | |
| CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7571 | |
| ChemiDoc XRS+ | Bio-Rad | 1708265 | |
| DMF, anhydrous, 99.8 % | Acros | 348435000 | Extra Dry over Molecular Sieve |
| DMSO, anhydrous, 99.7 % | Acros | 348445000 | Extra Dry over Molecular Sieve |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 15523-1L-R | |
| Goat anti-mouse (HRP conjugated) | Santa Cruz biotechnology | sc-2005 | |
| Halt Protease & Phosphatase Inhibitor Single-use Cocktail (100X) | Thermo Scientific | 1861280 | |
| Ikaros (D6N9Y) Mab | Cell signaling | 14859S | |
| ImmobilonP Transfer Membrane (0,45µm) | Merck | IPVH000010 | |
| Iodomethane, 99 % | Sigma-Aldrich | I8507 | Highly toxic |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 32213-2.5L | |
| Mg132 | Selleckchem | S2619 | |
| Mini Trans-Blot electrophoretic transfer cell | Bio-Rad | 1703930 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 1658004 | |
| MLN4942 | biomol (cayman) | Cay15217-1 | |
| Monoclonal Anti-α-Tubulin antibody produced in mouse (B512) | Sigma | T5168 | |
| N-Ethyldiisopropylamine, 99 % | Alfa Aesar | A11801 | |
| Nonfat dried milk powder | PanReac AppliChem | A0830,0500 | |
| Nunc F96 MicroWell White Polystyrene Plate | Thermo Scientific | 136101 | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | Thermo Scientific | NP0008 | |
| Pierce BCA Protein Assay kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Pomalidomide | Selleckchem | S1567 | |
| RestoreTM Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientific | 46430 | |
| sodium dodecyl sulfate | Carl Roth | 183.1 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | A9539-500g | |
| TEMED | Carl Roth | 2367.3 | |
| tert-Butyl N-[2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl]carbamate | Sigma-Aldrich | 89761 | Compound 5 |
| Tricin | Carl Roth | 6977.4 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503-1kg | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949-500ml | |
| WesternBright ECL spray | Advansta | K-12049-D50 |
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