マウス気管からのブラシ細胞の単離と定量的評価
Summary
ブラシ細胞は、ナイーブマウス気管に見られる稀なコリン作動性化学感覚上皮細胞である。その限られた数のために、気道免疫および改造におけるその機能的役割のex vivo評価は困難である。フローサイトメトリーによる気管ブラシ細胞の単離方法について述べた。
Abstract
気管ブラシ細胞は、気道内腔から免疫系および神経系に信号を伝達する準備ができているコリン作動性化学感覚上皮細胞である。それらは、腸粘膜のタフト細胞、気管のブラシ細胞、鼻粘膜の孤独な化学感覚および微小絨毛細胞を含む化学感覚上皮細胞のファミリーの一部である。異なる上皮区画の化学感覚細胞は、主要な細胞内マーカーとコア転写部特質を共有するが、局所組織環境を反映する可能性が高い重要な転写不均一性も示す。単一細胞懸濁液からの気管ブラシ細胞の単離は、これらのまれな上皮細胞の機能を詳細に定義する必要があるが、それらの分離は、気管ブラシ細胞と神経終末との間の密接な相互作用のために、潜在的に困難である。またはタイトで接着接点の気道固有の組成物に起因する。ここでは、マウス気管上皮からブラシ細胞を単離する手順について説明する。この方法は、管下上皮の初期分離に基づいており、パパインを用いて上皮シートのその後の短いインキュベーションを可能にする。この手順は、生存可能な気管ブラシ細胞のフローサイトメトリックソートおよび機能解析のための迅速かつ便利なソリューションを提供します。
Introduction
ブラシ細胞は、苦味受容体および味覚芽細胞に見られる味覚受容体伝達機構の発現を特徴とする化学感覚上皮細胞のクラスに属する。味覚芽細胞とは異なり、化学感覚上皮細胞は上皮表面に散乱し、鼻上皮1、2、気管内のブラシ細胞中の孤独な化学感覚細胞(SCC)および微小絨毛細胞と呼ばれる。腸内の3、4、およびタフト細胞5、6.苦味受容体および苦味伝達機構を発現する上皮細胞は、尿道7、8および聴覚管9にも見出される。気道ブラシ細胞は、神経原性および免疫気道応答にユニークな機能を有する。彼らは、苦い化合物とクォーラム感知物質のような細菌代謝物で活性化時に保護呼吸反射を呼び起こすアセチルコリン産生化学感覚細胞です 10.気道ブラシ細胞はまた、気道3のエアロアレルゲン引き出された2型炎症を調節するIL-25の支配的な気道上皮源である。
下部気道ブラシ細胞の完全な転写物の特徴付けおよび環境刺激への応答は、気管上皮の低い数および大きな気管支10を超える非常に限られた数によって制限されている。腸上皮からの化学感覚細胞の単離に使用される技術は、おそらく神経終末10または他の気管ブラシ細胞の親密な接触のために、気管から比例して高い数を得ていない付着物およびタイトジャンクションタンパク質の組成のような呼吸粘膜における組織特異的因子。単一細胞RNAシーケンシング分析のためのより高い数で気管ブラシ細胞の分離に成功した最近の報告は、パパインとの2時間インキュベーションまたはプロナス11、12との18時間インキュベーションのいずれかを採用した。消化酵素を用いたより長いインキュベーションは細胞の生存率を低下させ、消化された組織13からの細胞の転写プロファイルを変化させることができるので、これは他の化学感覚上皮集団との比較分析に偏りを与える可能性がある。
ここでは、RNAシーケンシング3に対する気管ブラシ細胞の単離方法を報告する。高用量ジスパーゼによる気管の治療は、上皮を粘膜下から分離する。パパインとの上皮シートのその後の消化は、この構造細胞の優れた回復を可能にする。
Protocol
以下の実験を行う前に、すべての動物ケアの使用とプロトコルが機関動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認され、国家研究評議会の「ケアと使用に関するガイド」に従って実施されることを確認してください。実験動物」( 第8版、2011年)とARRIVEガイドライン。以下に説明するすべての手順は、ブリガム・アンド・ウィメンズ病院の施設動物ケア・使用委員会によっ…
Representative Results
この手順は、RNA シーケンシング3の気管ブラシ 細胞を分離するために正常に実装されています。2段階プロトコル(図1)で気管を単離し、組織を消化した後、細胞を収集し、PIで死んだ細胞を排除した後に蛍光標識CD45およびEpCAMで染色した。前方および側面散乱特性に基づいて二重化を行った後、ブラシセルをCD45の場合は低/負、EpCAMでは正、eGFPでは陽性(<…
Discussion
我々は、40分間の高用量ジスパーゼ治療の組み合わせと短いパパイン治療(30分)が気管消化およびブラシ細胞分離に最適なプロトコルを提供することを見出した。この組み合わせは、広範な消化を回避し、代替プロトコルと比較して、ブラシ細胞の最高収率を生成します。
血行細胞を抽出する肺消化は、古典的にコラゲナーゼIV15のような軽度の消化酵素?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ブリガムと女性の人間免疫学センターフローコアのアダム・チコインに感謝します。この研究は、国立衛生補助金研究所R01 HL120952(N.A.B.)、R01 AI134989(N.A.B)、U19 AI095219(N.A.B.、 L.G.B)、K08 AI132723(L.G.B)、および米国アレルギー・喘息・免疫学アカデミー(AAAAI)/アメリカ肺アレルギー呼吸器疾患賞(N.A.B.)、AAAAI財団教員育成賞(L.G.B.)、スティーブン・アンド・ジュディ・ケイ・ヤング・イノベーター賞(N.A.B.)、ジョイスリン・C・オースティン女性医師のキャリア開発基金(L.G.B.)、およびヴィニク家(L.G.B.)による寛大な寄付。
Materials
| Antibodies | |||
| Anti-GFP (Polyclonal goat Ig) | Abcam | cat# ab5450 | |
| APC anti-mouse CD326 (EpCAM) (G8.8) | Biolegend | cat#118214 | |
| APC Rat IgG2a, k isotype control | Biolegend | cat#400511 | |
| DAPI | Biolegend | cat#422801 | |
| Donkey anti-goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Life Technologies/Molecular Probes | cat#A-11055 | |
| Normal Goat IgG | R&D Systems | cat#AB-108-C | |
| Pacific Blue anti-mouse CD45 (30F-11) | Biolegend | cat#103126 | |
| Pacific Blue Rat IgG2b, k isotype control | Biolegend | cat#400627 | |
| TruStain FcX (anti-mouse CD16/32) Antibody | Biolegend | cat#101320 | |
| Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins | |||
| Dispase | Gibco | cat# 17105041 | |
| DNase I | Sigma | cat# 10104159001 | |
| HEPES-Tyrode’s Buffer Without Calcium (10 mM HEPES, 135 mM NaCl, 2.8 mM KCl, 1 mM MgCl2, 12 mM NaHCO3, 0.4 mM NaH2PO4, 0.25% BSA, 5.5 mM Glucose. Prepared in 18.2 megohms water and filtered through 0.22 µm filter | Boston BioProducts | cat# PY-912 | |
| Tyrode’s Solution (HEPES-Buffered) 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 25 mM HEPES, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 and 10 mM glucose. Prepared in 18.2 megohms water and filtered through 0.22 µm filter. ) | Boston BioProducts | cat# BSS-355 | |
| L-Cysteine | Sigma | cat# C7352 | |
| Leupeptin trifluoroacetate salt | Sigma | cat# L2023 | |
| Papain from papaya latex | Sigma | cat# P3125 | |
| Propidium iodide | Sigma | cat# P4170 | |
| Experimental Models: Organisms/Strains | |||
| ChATBAC-eGFP (B6.Cg-Tg(RP23-268L19-EGFP)2Mik/J) | The Jackson Laboratory | 7902 | |
| Equipment | |||
| LSM 800 with Airyscan confocal system on a Zeiss Axio Observer Z1 Inverted Microscope | Zeiss | ||
| LSRFortessa | BD | 647465 | |
| Disposable equipment | |||
| 1.5 mL sterile tubes | Thomas Scientific | 1157C86 | |
| 5 mL Poysterene Round-bottom Tube, 12 x 75 mm style | Falcon | 14-959-1A | |
| 50 mL Polypropylene conical tube, 30 x 115 mm style | Falcon | 352098 | |
| Feather Disposable Scalpel no.12 | Fisher Scientific | NC9999403 | |
| Petri dish, 100 x 15 mm Style | Falcon | 351029 | |
| Sterile cell strainer, 100 μm | Fisherbrand | cat#22363549 |
References
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Cite This Article
Ualiyeva, S., Yoshimoto, E., Barrett, N. A., Bankova, L. G. Isolation and Quantitative Evaluation of Brush Cells from Mouse Tracheas. J. Vis. Exp. (148), e59496, doi:10.3791/59496 (2019).