Aislamiento y evaluación cuantitativa de células de pincel de tráqueas de ratón
Summary
Las células del cepillo son células epiteliales quimiosensoriales colinérgicas raras que se encuentran en la tráquea de ratón ingenua. Debido a su número limitado, la evaluación ex vivo de su papel funcional en la inmunidad y remodelación de las vías respiratorias es un desafío. Describimos un método para el aislamiento de células de cepillo traqueal por citometría de flujo.
Abstract
Las células del cepillo traqueal son células epiteliales quimiosensoriales colinérgicas a las que se encuentra para transmitir señales desde el lumen de las vías respiratorias al sistema inmunitario y nervioso. Son parte de una familia de células epiteliales quimiosensoriales que incluyen células de mechón en la mucosa intestinal, células de cepillo en la tráquea, y células quimiosensoriales y microvasas solitarias en la mucosa nasal. Las células quimiosensoriales en diferentes compartimentos epiteliales comparten marcadores intracelulares clave y una firma transcripcional central, pero también muestran una heterogeneidad transcripcional significativa, probablemente reflejo del entorno tisular local. Se requiere aislamiento de las células del cepillo traqueal de las suspensiones de una sola célula para definir la función de estas células epiteliales raras en detalle, pero su aislamiento es difícil, potencialmente debido a la estrecha interacción entre las células del cepillo traqueal y las terminaciones nerviosas o debido a la composición específica de las vías respiratorias de uniones apretadas y adheridas. Aquí, describimos un procedimiento para el aislamiento de las células del cepillo del epitelio traqueal del ratón. El método se basa en una separación inicial del epitelio traqueal de la submucosa, lo que permite una posterior incubación más corta de la lámina epitelial con papaína. Este procedimiento ofrece una solución rápida y conveniente para la clasificación citométrica de flujo y el análisis funcional de células de cepillo traqueal viables.
Introduction
Las células de cepillo pertenecen a una clase de células epiteliales quimiosensoriales caracterizadas por la expresión de receptores de sabor amargo y la maquinaria de transducción de receptores de sabor que se encuentra en las células de los paladares. A diferencia de las células de los cogollos de sabor, las células epiteliales quimiosensoriales se dispersan en superficies epiteliales y se conocen como células quimiosensoriales solitarias (SCC) y células microvasas en el epitelio nasal1,2, células de cepillo en la tráquea 3,4, y células de mechón en el intestino5,6. Las células epiteliales que expresan receptores de sabor amargo y la maquinaria de transducción de sabor amargo también se encuentran en la uretra7,8 y el tubo auditivo9. Las células del cepillo de las vías respiratorias tienen funciones únicas en las respuestas neurogénicas e inmunitarias. Son células quimiosensoriales productoras de acetilcolina que evocan reflejos respiratorios protectores tras la activación con compuestos amargos y metabolitos bacterianos como las sustancias de observación de quórum10. Las células de cepillo de las vías respiratorias son también la fuente epitelial dominante dela VÍA respiratoria de IL-25, que regula la inflamación del tipo 2 con aeroallos en las vías respiratorias 3.
La caracterización del transcriptoma completo de las células del cepillo de las vías respiratorias inferiores y su respuesta a los estímulos ambientales se ha visto limitada por su bajo número en el epitelio traqueal y un número muy limitado más allá de los grandes bronquios10. Las técnicas utilizadas para el aislamiento de células quimiosensoriales del epitelio intestinal no han dado resultados proporcionalmente altos de la tráquea, posiblemente debido a los contactos íntimos de las células del cepillo traqueal con terminaciones nerviosas10 u otras factores específicos del tejido en la mucosa respiratoria, como la composición de adheridos y proteínas de unión apretada. Informes recientes de aislamiento exitoso de células de cepillo traqueal en números más altos para el análisis de secuenciación de ARN de una sola célula emplearon una incubación de 2 h con papaína o una incubación de 18 h con pronasa11,12. Dado que las incubaciones más largas con enzimas digestivas pueden disminuir la viabilidad celular y alterar el perfil transcripcional de las células de los tejidos digeridos13,esto podría sesgar el análisis comparativo con otras poblaciones epiteliales quimiosensoriales.
Aquí, informamos de un método para el aislamiento de células de cepillo traqueal para la secuenciación de ARN3. El tratamiento de la tráquea con dosis altas de dosis separa el epitelio de la submucosa. La digestión posterior de la lámina epitelial con papaína permite una excelente recuperación de esta célula estructural.
Protocol
Representative Results
Discussion
Encontramos que una combinación de tratamiento de dosis altas durante 40 minutos seguido de un tratamiento corto con papaína (30 min) proporciona un protocolo óptimo para la digestión traqueal y el aislamiento de células de cepillo. Esta combinación evita una digestión extensa y produce el mayor rendimiento de células de cepillo, en comparación con los protocolos alternativos.
Mientras que la digestión pulmonar para extraer células hematopoyéticas se ha basado clásicamente en enzi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Adam Chicoine en el Centro de Inmunología Humana de Brigham and Women’s Flow Core por su ayuda con la clasificación citométrica de flujo. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Subvenciones sanitarias R01 HL120952 (N.A.B.), R01 AI134989 (N.A.B), U19 AI095219 (N.A.B., L.G.B), y K08 AI132723 (L.G.B), y por la Academia Estadounidense de Alergia, Asma e Inmunología (AAAAI) / Alergia Pulmonar Americana Premio a la Enfermedad Respiratoria (N.A.B.), por el Premio de Desarrollo Docente de la Fundación AAAAI (L.G.B.), por el Premio Steven y Judy Kaye Young Innovators (N.A.B.), por el Fondo Joycelyn C. Austen para el Desarrollo Profesional de Mujeres Científicas Médicas (L.G.B.), y por un generosa donación de la familia Vinik (L.G.B.).
Materials
| Antibodies | |||
| Anti-GFP (Polyclonal goat Ig) | Abcam | cat# ab5450 | |
| APC anti-mouse CD326 (EpCAM) (G8.8) | Biolegend | cat#118214 | |
| APC Rat IgG2a, k isotype control | Biolegend | cat#400511 | |
| DAPI | Biolegend | cat#422801 | |
| Donkey anti-goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Life Technologies/Molecular Probes | cat#A-11055 | |
| Normal Goat IgG | R&D Systems | cat#AB-108-C | |
| Pacific Blue anti-mouse CD45 (30F-11) | Biolegend | cat#103126 | |
| Pacific Blue Rat IgG2b, k isotype control | Biolegend | cat#400627 | |
| TruStain FcX (anti-mouse CD16/32) Antibody | Biolegend | cat#101320 | |
| Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins | |||
| Dispase | Gibco | cat# 17105041 | |
| DNase I | Sigma | cat# 10104159001 | |
| HEPES-Tyrode’s Buffer Without Calcium (10 mM HEPES, 135 mM NaCl, 2.8 mM KCl, 1 mM MgCl2, 12 mM NaHCO3, 0.4 mM NaH2PO4, 0.25% BSA, 5.5 mM Glucose. Prepared in 18.2 megohms water and filtered through 0.22 µm filter | Boston BioProducts | cat# PY-912 | |
| Tyrode’s Solution (HEPES-Buffered) 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 25 mM HEPES, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 and 10 mM glucose. Prepared in 18.2 megohms water and filtered through 0.22 µm filter. ) | Boston BioProducts | cat# BSS-355 | |
| L-Cysteine | Sigma | cat# C7352 | |
| Leupeptin trifluoroacetate salt | Sigma | cat# L2023 | |
| Papain from papaya latex | Sigma | cat# P3125 | |
| Propidium iodide | Sigma | cat# P4170 | |
| Experimental Models: Organisms/Strains | |||
| ChATBAC-eGFP (B6.Cg-Tg(RP23-268L19-EGFP)2Mik/J) | The Jackson Laboratory | 7902 | |
| Equipment | |||
| LSM 800 with Airyscan confocal system on a Zeiss Axio Observer Z1 Inverted Microscope | Zeiss | ||
| LSRFortessa | BD | 647465 | |
| Disposable equipment | |||
| 1.5 mL sterile tubes | Thomas Scientific | 1157C86 | |
| 5 mL Poysterene Round-bottom Tube, 12 x 75 mm style | Falcon | 14-959-1A | |
| 50 mL Polypropylene conical tube, 30 x 115 mm style | Falcon | 352098 | |
| Feather Disposable Scalpel no.12 | Fisher Scientific | NC9999403 | |
| Petri dish, 100 x 15 mm Style | Falcon | 351029 | |
| Sterile cell strainer, 100 μm | Fisherbrand | cat#22363549 |
References
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