मॉडलिंग स्तन कैंसर माउस मैमरी Gland में क्रे-एडिनोवायरस के एक इंट्राडकियल इंजेक्शन के माध्यम से
Summary
इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य माउस स्तन ग्रंथियों में क्रे-सब्सक्राइफिंग एडेनोवायरस के इंट्राडक्टल इंजेक्शन के आधार पर एक नए स्तन कैंसर मॉडलिंग दृष्टिकोण का वर्णन करना है। यह दृष्टिकोण दोनों सेल प्रकार की अनुमति देता है- और एक लौकिक नियंत्रित तरीके से oncogenic घटनाओं के अंग विशेष हेरफेर.
Abstract
स्तन कैंसर एक विषमांगी रोग है, संभवतः मूल और oncogenic घटनाओं के विभिन्न कोशिकाओं के बीच जटिल बातचीत के कारण. माउस मॉडल इन जटिल प्रक्रियाओं में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है. हालांकि कई माउस मॉडल विभिन्न oncogenic घटनाओं और स्तन tumorigenesis के लिए मूल की कोशिकाओं के योगदान का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है, इन मॉडलों अक्सर सेल प्रकार या अंग विशिष्ट नहीं हैं या एक में स्तन tumorigenesis की दीक्षा प्रेरित नहीं कर सकते लौकिक रूप से नियंत्रित तरीके से। यहाँ हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए स्तन कैंसर माउस मॉडल के एक नए प्रकार के आधार पर Cre-expressing एडेनोवायरस (विज्ञापन-Cre) माउस स्तन ग्रंथियों (MGs) में intraductal इंजेक्शन उत्पन्न करने के लिए. स्तन नलिकाओं में विज्ञापन-क्री के प्रत्यक्ष इंजेक्शन के कारण, इस दृष्टिकोण एमजी विशिष्ट है, अन्य अंगों में किसी भी अवांछित कैंसर प्रेरण के बिना. इंट्राडकटल इंजेक्शन प्रक्रिया चूहों में उनके एमजी विकास के विभिन्न चरणों में किया जा सकता है (इस प्रकार, यह कैंसर प्रेरण के अस्थायी नियंत्रण की अनुमति देता है, उम्र के 3-4 सप्ताह से शुरू). सेल-प्रकार की विशिष्टता एडेनोवायरल वेक्टर में क्रे एक्सप्रेशन को ड्राइव करने के लिए विभिन्न सेल-प्रकार-विशिष्ट प्रमोटरों का उपयोग करके प्राप्त की जा सकती है। हम बताते हैं कि luminal और बेसल स्तन उपकला कोशिकाओं (MECs) कसकर Cre/loxP के लिए लक्षित किया जा सकता है आधारित आनुवंशिक हेरफेर के नियंत्रण में विज्ञापन-Cre के एक intraductal इंजेक्शन के माध्यम से 8 या Keratin 5 प्रमोटर, क्रमशः. एक सशर्त क्रे रिपोर्टर को शामिल करके (जैसे, Cre/loxP-प्रेरित Rosa26-YFP रिपोर्टर), हम बताते हैं कि एमईसी विज्ञापन-Cre द्वारा लक्षित है, और ट्यूमर कोशिकाओं उन से व्युत्पन्न, इंट्रासेटल इंजेक्शन के बाद रिपोर्टर सकारात्मक कोशिकाओं का पालन करके पता लगाया जा सकता है।
Introduction
इस विधि का समग्र लक्ष्य माउस एमजी में विज्ञापन-क्री के एक इंट्राडकल इंजेक्शन के आधार पर एक नया स्तन कैंसर मॉडलिंग दृष्टिकोण विकसित करने के लिए है। Cre/loxP पुनर्संयोजन आधारित आनुवंशिक दृष्टिकोण व्यापक रूप से चूहों में मानव स्तन कैंसर मॉडल के लिए इस्तेमाल किया गया है. Cre/loxP आधारित स्तन कैंसर माउस मॉडल की पहली पीढ़ी MEC-विशिष्ट प्रमोटरों के नियंत्रण में Cre-expressing ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग करके उत्पन्न कर रहे हैं (उदाहरण के लिए, MMTV-Cre luminal MECs के लिए और बेसल MECs के एक हिस्से, Wap-Cre और Blg-Cre के लिए luminal संतति और कूपिका luminal MECs, K14-Cre के लिए बेसल और luminal MECs के एक हिस्से1,2,3,4,5)6, 7 , 8 , 9.हालांकि, जबकि ये क्रे ट्रांसजेनिक लाइनें क्रे अभिव्यक्ति के स्थानिक नियंत्रण को सक्षम करती हैं (यानी, एमईसी के विभिन्न सबसेटों में), वे क्रे अभिव्यक्ति और क्रे/लोक्सपी-मध्यस्थ आनुवंशिक हेरफेर के अस्थायी नियंत्रण की अनुमति नहीं देते हैं। Cre/loxP-आधारित स्तन कैंसर माउस मॉडल की दूसरी पीढ़ी inducible Cre activity/expression दृष्टिकोण का उपयोग (जैसे, Cre-एस्ट्रोजन रिसेप्टर संलयन [CreER] का उपयोग, जो केवल tamoxifen के प्रशासन पर Cre/loxP पुनर्संयोजन प्रेरित कर सकते हैं), और एक परिणाम के रूप में, इन आनुवंशिक उपकरण MECs में oncogenic घटनाओं के सक्रियण के स्थानिक और लौकिक नियंत्रण दोनों की अनुमति (जैसे, K8-Creer– और K5-Creerआधारित मॉडल)10,11,12 . स्तन कैंसर माउस मॉडल की दोनों पीढ़ियों में, के रूप में प्रमोटरों Cre या CreER अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए इस्तेमाल किया (जैसे, Krt8, Krt5) भी अन्य अंगों के उपकला कोशिकाओं में सक्रिय हो सकता है (यानी, वे सेल-प्रकार के हैं विशिष्ट लेकिन अंग विशिष्ट नहीं) या उपकला कोशिकाओं के अलावा अन्य प्रकार के सेल प्रकार में एक लीक अभिव्यक्ति है (उदा., MMTV, जो अस्थि मज्जा hematopoietic कोशिकाओं में लीक गतिविधि है), इन दृष्टिकोण अन्य अंगों में अवांछित कैंसर (ओं) के विकास के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. यदि इन अप्रत्याशित कैंसर प्रभावित चूहों में घातक कारण, इन चूहों में स्तन कैंसर मॉडलिंग का मूल उद्देश्य निषिद्ध किया जा सकता है (जैसे, MMTV-Creसंचालित oncogenic घटनाओं hematopoietic द्रोह और चूहों की जल्दी मौत के लिए नेतृत्व कर सकते हैं , हेमेटोपोइटिक कोशिकाओं में एमएमटीवी प्रमोटर के रिसाव के कारण)4.
यहाँ हम चूहों में एक स्तन कैंसर मॉडलिंग दृष्टिकोण है कि दोनों सेल प्रकार की अनुमति देता है रिपोर्ट- और एक लौकिक नियंत्रित तरीके से oncogenic घटनाओं के अंग विशेष हेरफेर. यह दृष्टिकोण माउस MGs में विज्ञापन-Cre के एक intraductal इंजेक्शन पर आधारित है (और है, इस प्रकार, अंग विशिष्ट). क्रे अभिव्यक्ति को एडेनोवायरल वेक्टर में एम्बेड किए गए विभिन्न एमईसी उप-जनसंख्या-विशिष्ट प्रमोटरों का उपयोग करके नियंत्रित किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, एल्मिनल एमईसी के लिए Krt8, बेसल एमईसी के लिए Krt5, इस प्रकार सेल-प्रकार विशिष्टता प्राप्त करना)। MGs में कैंसर प्रेरण अस्थायी रूप से अलग अलग उम्र में चूहों में विज्ञापन-क्रे के एक इंजेक्शन द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है, उम्र के 3-4 सप्ताह से शुरू (pubertal) वयस्क चरण के लिए.
Protocol
Representative Results
Discussion
MECs के विभिन्न subpopulations से स्तन ट्यूमर inducing के लिए इस दृष्टिकोण की सफलता न केवल उचित सेल-प्रकार-विशिष्ट प्रमोटरों को चुनने पर निर्भर करता है (क्रे अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए) लेकिन यह भी intraductal इंजेक्शन प्रक?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) अनुदान R01 CA222560 और रक्षा निर्णायक पुरस्कार W81XWH-18-1-0037 द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| 33-gauge needle | Hamilton | 7803-05 | point style 3 blunt |
| 7mm Reflex Clip | Braintree Scientific | RF7 CS | |
| Adenovirus, Ad-K5-Cre | University of Iowa Viral Vector Core | Ad5-bk5-Cre (VVC-Berns-1547) | |
| Adenovirus, Ad-K8-Cre | University of Iowa Viral Vector Core | Ad5mK8-nlsCre | |
| Alcohol | Fisher | HC800-1GAL | Prepare to 70% in use |
| biotinylated CD31 | eBiosciences | 13-0311-85 | |
| biotinylated CD45 | eBiosciences | 13-0451-85 | |
| biotinylated TER119 | eBiosciences | 13-5921-85 | |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| CD24-AF-700 | BD Pharmingen | 564237 | |
| CD24-PE | eBiosciences | 12-0242-83 | |
| CD29-APC | eBiosciences | 17-0291-82 | |
| CD29-PE | eBiosciences | 12-0291-82 | |
| Hair Remover Lotion | Nair | 9 Oz | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 7636-01 | 0.025 mL |
| Iodophors | Betadine | 10% Povidone-iodine | |
| Isoflurane | Baxter | NDC 10019-360-40 | 1-2.5% |
| Loxicam | Norbrook | NDC 55529-040-10 | 5 mg/ml |
| Lubricant Eye Ointment | Akorn | NDC 17478-062-35 | |
| Micro-dissecting scissors | Pentair | 9M | Watchmaker's Forceps |
| Micro-dissecting tweezers | Dumont | M5 | |
| Taq 5X Master Mix | New England Biolabs | M0285L | |
References
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