마우스 유방 동맥에 Cre 발현 아데노 바이러스의 경막 주사를 통해 유방암 모델링
Summary
이 프로토콜의 목표는 마우스 유방 땀샘으로 Cre 발현 아데노바이러스의 자궁 내 주입에 기초한 새로운 유방암 모델링 접근을 기술하는 것입니다. 이 접근은 세포 모형 및 기관 특정 조작을 시간적으로 통제한 방식으로 oncogenic 사건을 둘 다 허용합니다.
Abstract
유방암은 이기종 질병, 기원의 다른 세포 와 종양 발생 이벤트 사이의 복잡 한 상호 작용 때문일 수 있습니다. 마우스 모델은 이러한 복잡한 프로세스에 대한 통찰력을 얻는 데 중요한 역할을 합니다. 많은 마우스 모형이 유방 종양발생에 각종 종양 발생및 기원의 세포의 기여를 공부하기 위하여 개발되었더라도, 이 모형은 수시로 세포 모형 또는 기관 특정이 아니거나 유방 종양 발생의 개시를 유도할 수 없습니다 일시적으로 제어 방식. 여기에서 우리는 마우스 유방 땀샘 (MGs)으로 Cre 발현 아데노 바이러스 (Ad-Cre)의 경막 주사에 근거를 둔 유방암 마우스 모형의 새로운 모형을 생성하는 프로토콜을 기술합니다. 유선 덕트에 Ad-Cre를 직접 주입하기 때문에이 접근법은 다른 장기에서 원치 않는 암 유도없이 MG 특정입니다. 경막 주사 절차는 MG 발달의 다른 단계에서 마우스에서 수행 될 수있다 (따라서, 그것은 암 유도의 시간적 제어를 허용, ~에서 시작 ~3-4 나이의 주). 세포 형 특이성은 아데노 바이러스 벡터에서 Cre 발현을 유도하기 위해 상이한 세포 형 특이적 프로모터를 사용하여 달성될 수 있다. 우리는 발광 및 기저 유방 상피 세포 (MECs)가 각각 케라틴 8 또는 케라틴 5 프로모터의 통제하에 Ad-Cre의 경막 주사를 통해 Cre /loxP 기반 유전자 조작을 위해 단단히 표적으로 할 수 있음을 보여줍니다. 조건부 Cre 리포터(예를 들어, Cre/loxP-유도성 Rosa26-YFP 리포터)를 통합함으로써, 우리는 Ad-Cre에 의해 표적화된 MECs, 및 그로부터 유래된 종양 세포가, 유도 내 주사 후 리포터 양성 세포를 따라 추적될 수 있음을 보여준다.
Introduction
이 방법의 전반적인 목표는 마우스 MG에 Ad-Cre의 경내 주입에 근거를 둔 새로운 유방암 모델링 접근을 개발하는 것입니다. Cre/loxP 재조합 기반 유전 적 접근법은 마우스에서 인간 유방암을 모델링하는 데 널리 사용되어 왔습니다. Cre/loxP 기반 유방암 마우스 모델의 1세대는 MEC 특이적 프로모터(예: 광ME및 기저 MEC의 일부인 MMTV-Cre) 및 기저 MEC의 일부, Wap-Cre 및 발광 선조 및 폐포 광도 MEC, K14-Cre 기저 및 발광 MEC의 일부에 대한 Blg-Cre 1, 2,3,4,5)6, 7명 , 8개 , 9. 그러나, 이러한 Cre 형질전환 선은 Cre 발현의 공간 제어를 가능하게하지만 (즉, MEC의 다른 하위 세트에서), 그들은 Cre 발현 및 Cre / loxP 매개 유전 조작의 시간적 제어를 허용하지 않습니다. Cre/loxP 기반 유방암 마우스 모델의 2세대는 유도성 Cre 활성/발현 접근법을 활용합니다(예를 들어, 타목시펜 투여 시 크레/록스P 재조합을 유도할 수 있는 Cre-에스트로겐 수용체 융합[CreER]의 사용),, 그 결과, 이러한 유전 적 도구는 MECs에서 의 한인 발생 이벤트의 활성화의 공간 적 및 시간적 제어를 모두 허용 (예를 들어, K8-CreER– 및 K5-CreER기반 모델)10,11,12 . 유방암 마우스 모델의 두 세대에서, Cre 또는 CreER 발현을 구동하는 데 사용되는 프로모터로서 (예를 들어, Krt8, Krt5)또한 다른 장기의 상피 세포에서 활성화 될 수있다 (즉, 그들은 세포 유형 특이적이지만 장기 특이적이지 않음) 또는 상피 세포 이외의 세포 유형에서 새는 발현을 가지고 (예를 들어, MMTV,이는 골수 조혈 세포에서 새는 활성을 가지고), 이러한 접근 방식은 다른 기관에서 원치 않는 암의 개발로 이어질 수 있습니다.. 이러한 예기치 않은 암이 영향을받는 마우스에서 치사를 일으키는 경우,이 마우스에서 유방암을 모델링하는 원래의 목적은 금지 될 수있다 (예를 들어, MMTV-Cre-구동 종양 발생 이벤트는 조혈 악성 종양과 마우스의 조기 사망으로 이어질 수 있습니다 , 조혈 세포에서 MMTV 프로모터의 누설로 인해)4.
여기에서 우리는 일시적으로 통제된 방식으로 세포 모형 및 기관 특정 조작을 둘 다 허용하는 마우스에 있는 유방암 모델링 접근을 보고합니다. 이 접근법은 마우스 MGs에 Ad-Cre의 내 삽입을 기반으로 합니다 (따라서 장기별). Cre 발현은 아데노바이러스 벡터에 내장된 상이한 MEC 서브모멘트 특이적 프로모터를 사용하여 제어될 수 있다(예를 들어, 발광 MEC의 경우, 기저 MEC의 경우 Krt8, 따라서 세포 형 특이성을 달성). MGs에 있는 암 유도는 성인 단계에 나이의 3-4 주 (사춘기)에서 시작하여 다른 나이에 마우스로 Ad-Cre의 주입에 의해 일시적으로 통제될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
MECs의 다른 하위 집단에서 유방 종양을 유도하기위한이 접근법의 성공은 적절한 세포 유형 특이적 프로모터를 선택하는 것뿐만 아니라 (Cre 발현을 유도하기 위해) 뿐만 아니라 자궁 내 주사 절차 자체에 의존합니다. 이 접근의 뒤에 아이디어는 주입된 Ad-Cre 바이러스가 루멘을 가진 은폐한 구조물인 덕트 트리에서 유지된다는 것입니다, 그러므로, 단지 MECs는 바이러스에 드러내고 Ad-Cre에 의해 감염…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 국립 보건원 (NIH) 교부금 R01 CA222560및 국방부 획기적인 상 W81XWH-18-1-0037에 의해 지원되었습니다.
Materials
| 33-gauge needle | Hamilton | 7803-05 | point style 3 blunt |
| 7mm Reflex Clip | Braintree Scientific | RF7 CS | |
| Adenovirus, Ad-K5-Cre | University of Iowa Viral Vector Core | Ad5-bk5-Cre (VVC-Berns-1547) | |
| Adenovirus, Ad-K8-Cre | University of Iowa Viral Vector Core | Ad5mK8-nlsCre | |
| Alcohol | Fisher | HC800-1GAL | Prepare to 70% in use |
| biotinylated CD31 | eBiosciences | 13-0311-85 | |
| biotinylated CD45 | eBiosciences | 13-0451-85 | |
| biotinylated TER119 | eBiosciences | 13-5921-85 | |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| CD24-AF-700 | BD Pharmingen | 564237 | |
| CD24-PE | eBiosciences | 12-0242-83 | |
| CD29-APC | eBiosciences | 17-0291-82 | |
| CD29-PE | eBiosciences | 12-0291-82 | |
| Hair Remover Lotion | Nair | 9 Oz | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 7636-01 | 0.025 mL |
| Iodophors | Betadine | 10% Povidone-iodine | |
| Isoflurane | Baxter | NDC 10019-360-40 | 1-2.5% |
| Loxicam | Norbrook | NDC 55529-040-10 | 5 mg/ml |
| Lubricant Eye Ointment | Akorn | NDC 17478-062-35 | |
| Micro-dissecting scissors | Pentair | 9M | Watchmaker's Forceps |
| Micro-dissecting tweezers | Dumont | M5 | |
| Taq 5X Master Mix | New England Biolabs | M0285L | |
References
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