Modellare il cancro al seno tramite un'iniezione intraduttiva di adenovirus che esprime la creminazione nella ghiandola mammaria del topo
Summary
L’obiettivo di questo protocollo è descrivere un nuovo approccio di modellazione del cancro al seno basato sull’iniezione intraduttiva di adenovirus che esprime Cre nelle ghiandole mammarie dei topi. Questo approccio consente la manipolazione sia di tipo cellulare che di un organo degli eventi oncogeni in modo controllato temporaneamente.
Abstract
Il cancro al seno è una malattia eterogenea, probabilmente a causa di complesse interazioni tra diverse cellule di origine ed eventi oncogeni. I modelli di topo sono fondamentali per ottenere informazioni approfondite su questi processi complessi. Sebbene molti modelli murini siano stati sviluppati per studiare i contributi di vari eventi oncogeni e cellule di origine alla tumorigenesi mammaria, questi modelli spesso non sono di tipo cellulare o organo specifico o non possono indurre l’avvio della tumorigenesi mammaria in un modo controllato temporaneamente. Qui descriviamo un protocollo per generare un nuovo tipo di modelli di topo di cancro al seno basati sull’iniezione intraduttiva di adenovirus che esprime Cre (Ad-Cre) nelle ghiandole mammarie del topo (MG). A causa dell’iniezione diretta di Ad-Cre nei dotti mammari, questo approccio è specifico di MG, senza alcuna induzione indesiderata del cancro in altri organi. La procedura di iniezione intraduttiva può essere eseguita nei topi in diverse fasi del loro sviluppo di MG (quindi, permette il controllo temporale dell’induzione del cancro, a partire da 3-4 settimane di età). La specificità del tipo di cellula può essere ottenuta utilizzando diversi promotori specifici del tipo di cellula per guidare l’espressione Cre nel vettore adenovirale. Dimostriamo che le cellule epiteliali mammarie luminali e basali (MEC) possono essere strettamente mirate per la manipolazione genetica basata su Cre/loxP tramite un’iniezione intraduttiva di Ad-Cre sotto il controllo del promotore Keratin 8 o Keratin 5, rispettivamente. Incorporando un reporter Cre condizionale (ad esempio, Reporter Inducibile in Cre/loxP Rosa26-YFP), mostriamo che i MEC presi di mira da Ad-Cre, e le cellule tumorali da essi derivate, possono essere rintracciati seguendo le cellule reporter-positive dopo l’iniezione intraductale.
Introduction
L’obiettivo generale di questo metodo è quello di sviluppare un nuovo approccio di modellazione del cancro al seno basato su un’iniezione intraduttiva di Ad-Cre nel topo MG. L’approccio genetico basato sulla ricombinazione Cre/loxP è stato ampiamente utilizzato per modellare il cancro al seno umano nei topi. La prima generazione di modelli di topo di carcinoma mammario a base di Cre/loxP viene generata utilizzando topi transgenici che esprimono Cre-expressing sotto il controllo di promotori specifici del MEC (ad esempio, MMTV-Cre per i MEC luminosi e una porzione di MEC basali, Wap-Cre e Blg-Cre per progenitori luminali e MEC luminali alveolar, K14-Cre per basale e una porzione di MEC luminali1,2,3,4,5)6, 7 (in questo stato , 8 (IN vio , 9. , tuttavia, sebbene queste linee transgeniche Del Cre consentano il controllo spaziale dell’espressione Cre (cioè in diversi sottoinsiemi di MEC), non consentono il controllo temporale dell’espressione Cre e della manipolazione genetica mediata da Cre/loxP. La seconda generazione di modelli di topo di carcinoma mammario basati su Cre/loxP utilizza approcci inducibili per l’attività/espressione del creme (ad esempio, l’uso della fusione del recettore Cre-estrogeno [CreER], che può indurre la ricombinazione Cre/loxP solo dopo la somministrazione di tamoxifene) e di conseguenza, questi strumenti genetici consentono controlli spaziali e temporali dell’attivazione di eventi oncogeni nei MEC (ad esempio, modelli basati su K8-CreER– e K5-CreER)10,11,12 . In entrambe le generazioni di modelli di topo di cancro al seno, come promotori utilizzati per guidare l’espressione Cre o CreER (ad esempio, Krt8, Krt5) possono anche essere attivi nelle cellule epiteliali di altri organi (cioè, sono specifiche di tipo di cellula ma non specifiche dell’organo) o hanno un’espressione che perde in tipi di cellule diverse dalle cellule epiteliali (ad esempio, MMTV, che ha un’attività che perde nelle cellule ematopoietiche del midollo osseo), questi approcci possono portare allo sviluppo di tumori indesiderati in altri organi. Se questi tumori inaspettati causano letalità nei topi colpiti, lo scopo originale della modellazione del cancro al seno in questi topi può essere vietato (ad esempio, eventi oncogeni MMTV-Cre-driven può portare a neoplasie ematopoietiche e morte precoce dei topi , a causa della perdita del promotore MMTV nelle cellule ematopoietiche)4.
Qui segnaliamo un approccio di modellazione del cancro al seno nei topi che consente la manipolazione sia tipo di cellula che organo-specifica degli eventi oncogeni in modo controllato materialmente. Questo approccio si basa su un’iniezione intraduttiva di Ad-Cre nelle MG del topo (ed è, quindi, specifico dell’organo). L’espressione del creme può essere controllata utilizzando diversi promotori specifici del MEC incorporati nel vettore adenovirale (ad esempio, Krt8 per MEC luminali, Krt5 per i MEC basali, ottenendo così la specificità del tipo di cellula). L’induzione del cancro nelle MG può essere controllata temporaneamente mediante un’iniezione di Ad-Cre nei topi di età diverse, a partire da 3-4 settimane di età (pageratale) allo stadio adulto.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il successo di questo approccio per indurre tumori mammari provenienti da diverse sottopopolazioni di MEC si basa non solo sulla scelta di promotori specifici del tipo di cellula appropriati (per guidare l’espressione Cre), ma anche sulla procedura di iniezione intraduttiva stessa. L’idea alla base di questo approccio è che i virus Ad-Cre iniettati sono conservati nell’albero duttale, che è una struttura nascosta con lumen, e quindi, solo i MEC sono esposti ai virus e sono infettati da Ad-Cre. A causa dello spazio limi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dalla concessione R01 CA222560 dei National Institutes of Health (NIH) e dal Department of Defense Breakthrough Award W81XWH-18-1-0037.
Materials
| 33-gauge needle | Hamilton | 7803-05 | point style 3 blunt |
| 7mm Reflex Clip | Braintree Scientific | RF7 CS | |
| Adenovirus, Ad-K5-Cre | University of Iowa Viral Vector Core | Ad5-bk5-Cre (VVC-Berns-1547) | |
| Adenovirus, Ad-K8-Cre | University of Iowa Viral Vector Core | Ad5mK8-nlsCre | |
| Alcohol | Fisher | HC800-1GAL | Prepare to 70% in use |
| biotinylated CD31 | eBiosciences | 13-0311-85 | |
| biotinylated CD45 | eBiosciences | 13-0451-85 | |
| biotinylated TER119 | eBiosciences | 13-5921-85 | |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| CD24-AF-700 | BD Pharmingen | 564237 | |
| CD24-PE | eBiosciences | 12-0242-83 | |
| CD29-APC | eBiosciences | 17-0291-82 | |
| CD29-PE | eBiosciences | 12-0291-82 | |
| Hair Remover Lotion | Nair | 9 Oz | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 7636-01 | 0.025 mL |
| Iodophors | Betadine | 10% Povidone-iodine | |
| Isoflurane | Baxter | NDC 10019-360-40 | 1-2.5% |
| Loxicam | Norbrook | NDC 55529-040-10 | 5 mg/ml |
| Lubricant Eye Ointment | Akorn | NDC 17478-062-35 | |
| Micro-dissecting scissors | Pentair | 9M | Watchmaker's Forceps |
| Micro-dissecting tweezers | Dumont | M5 | |
| Taq 5X Master Mix | New England Biolabs | M0285L | |
References
- Wagner, K. U., et al. Cre-mediated gene deletion in the mammary gland. Nucleic Acids Research. 25 (21), 4323-4330 (1997).
- Selbert, S., et al. Efficient BLG-Cre mediated gene deletion in the mammary gland. Transgenic Research. 7 (5), 387-396 (1998).
- Jonkers, J., et al. Synergistic tumor suppressor activity of BRCA2 and p53 in a conditional mouse model for breast cancer. Nature Genetics. 29 (4), 418-425 (2001).
- van Bragt, M. P., Hu, X., Xie, Y., Li, Z. RUNX1, a transcription factor mutated in breast cancer, controls the fate of ER-positive mammary luminal cells. eLife. 3, e03881 (2014).
- Tao, L., van Bragt, M. P., Li, Z. A Long-Lived Luminal Subpopulation Enriched with Alveolar Progenitors Serves as Cellular Origin of Heterogeneous Mammary Tumors. Stem Cell Reports. 5 (1), 60-74 (2015).
- Xu, X., et al. Conditional mutation of Brca1 in mammary epithelial cells results in blunted ductal morphogenesis and tumour formation. Nature Genetics. 22 (1), 37-43 (1999).
- Li, Z., et al. ETV6-NTRK3 fusion oncogene initiates breast cancer from committed mammary progenitors via activation of AP1 complex. Cancer Cell. 12 (6), 542-558 (2007).
- Liu, X., et al. Somatic loss of BRCA1 and p53 in mice induces mammary tumors with features of human BRCA1-mutated basal-like breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (29), 12111-12116 (2007).
- Molyneux, G., et al. BRCA1 basal-like breast cancers originate from luminal epithelial progenitors and not from basal stem cells. Cell Stem Cell. 7 (3), 403-417 (2010).
- Koren, S., et al. PIK3CA induces multipotency and multi-lineage mammary tumours. Nature. 525 (7567), 114-118 (2015).
- Van Keymeulen, A., et al. Reactivation of multipotency by oncogenic PIK3CA induces breast tumour heterogeneity. Nature. 525 (7567), 119-123 (2015).
- Tao, L., Xiang, D., Xie, Y., Bronson, R. T., Li, Z. Induced p53 loss in mouse luminal cells causes clonal expansion and development of mammary tumours. Nature Communications. 8, 14431 (2017).
- Tao, L., van Bragt, M. P. A., Laudadio, E., Li, Z. Lineage Tracing of Mammary Epithelial Cells Using Cell-Type-Specific Cre-Expressing Adenoviruses. Stem Cell Reports. 2 (6), 770-779 (2014).
- Sutherland, K. D., et al. Cell of origin of small cell lung cancer: inactivation of Trp53 and Rb1 in distinct cell types of adult mouse lung. Cancer Cell. 19 (6), 754-764 (2011).
- Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
- The Cancer Genome Atlas Network. Comprehensive molecular portraits of human breast tumours. Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).
- Nik-Zainal, S., et al. The life history of 21 breast cancers. Cell. 149 (5), 994-1007 (2012).
- Abba, M. C., et al. A Molecular Portrait of High-Grade Ductal Carcinoma In Situ. Cancer Research. 75 (18), 3980-3990 (2015).
