Modellering bröst cancer via en intraductal injektion av CRE-uttrycker adenovirus i musen bröstkörteln
Summary
Målet med detta protokoll är att beskriva en ny modell för bröstcancer modellering baserad på den intraduktalt injektion av CRE-uttrycker adenovirus i mus mjölkkörtlar. Detta tillvägagångssätt tillåter både cell-typ-och organspecifik manipulation av onkogena händelser på ett tidsmässigt kontrollerat sätt.
Abstract
Bröstcancer är en heterogen sjukdom, möjligen på grund av komplexa interaktioner mellan olika celler av ursprung och onkogena händelser. Musmodeller bidrar till att få insikter i dessa komplexa processer. Även om många musmodeller har utvecklats för att studera bidrag från olika onkogena händelser och celler av ursprung till bröst tumorigenes, dessa modeller är ofta inte cell-typ eller organspecifika eller kan inte inducera initiering av bröst tumorigenes i en på ett tidsmässigt kontrollerat sätt. Här beskriver vi ett protokoll för att generera en ny typ av bröstcancer musmodeller baserade på den intraduktalt injektion av CRE-uttrycker adenovirus (AD-CRE) i mus bröstkörtlar (MGS). På grund av direkt injektion av AD-CRE i bröst kanaler, detta tillvägagångssätt är MG specifik, utan någon oönskad cancerinduktion i andra organ. Den intraduktalt injektion förfarande kan utföras i möss i olika stadier av deras mg utveckling (alltså, det tillåter temporala kontroll av cancerinduktion, från ~ 3-4 veckors ålder). Den cell-typ specificitet kan uppnås genom att använda olika cell-typ-specifika initiativtagare att köra CRE uttryck i adenovirala vektor. Vi visar att luminala och basal bröst epitelceller (mecs) kan vara tätt riktade för CRE/loxP-baserad genetisk manipulation via en intraduktalt injektion av AD-CRE under kontroll av keratin 8 eller keratin 5 promotor, respektive. Genom att införliva en villkorlig CRE reporter (t. ex., CRE/loxP-inducible Rosa26-yfp reporter), visar vi att mecs riktade av AD-CRE, och tumörceller som härrör från dem, kan spåras genom att följa reportern-positiva celler efter intraduktalt injektion.
Introduction
Det övergripande målet med denna metod är att utveckla en ny modell för bröstcancer modellering baserat på en intraduktalt injektion av AD-CRE i mus mg. Den CRE/loxP recombination-baserade genetiska metoden har använts i stor utsträckning för att modellera Human bröstcancer hos möss. Den första generationen av CRE/loxP-baserade bröstcancer musmodeller genereras med hjälp av CRE-uttrycker transgena möss under kontroll av MEC-specifika initiativtagare (t. ex. Mmtv-CRE för luminala mecs och en del av basala mecs, WAP-CRE och BLG-CRE för luminala progenitorer och alveolära luminala mecs, k14-CRE för basal och en portion av luminala mecs1,2,3,4,5)6, 7 , 8 , 9. medan dessa CRE-transgena linjer möjliggör rumslig kontroll av CRE-uttryck (dvs. i olika delmängder av mecs) tillåter de dock inte temporala kontroller av CRE-uttryck och CRE/loxP-medierad genetisk manipulation. Den andra generationen av CRE/loxP-baserade bröstcancer musmodeller använder inducerbara CRE aktivitet/uttryck metoder (t. ex. användning av CRE-östrogen receptor fusion [CreER], som endast kan inducera CRE/loxP rekombination vid administrering av tamoxifen), och som ett resultat, dessa genetiska verktyg tillåter både rumsliga och temporala kontroller av aktiveringen av onkogena händelser i mecs (t. ex., K8-creer-och K5-creer-baserade modeller)10,11,12 . I båda generationerna av bröstcancer musmodeller, som initiativtagare används för att driva CRE eller CreER uttryck (t. ex., Krt8, Krt5) kan också vara aktiv i epitelceller i andra organ (dvs., de är cell-typ-specifika men inte organspecifika) eller har en läckande uttryck i andra celltyper än epitelceller (t. ex., Mmtv, som har läckande aktivitet i benmärgs hematopoietiska celler), dessa metoder kan leda till utveckling av oönskade cancer (s) i andra organ (s). Om dessa oväntade cancerformer orsakar dödlighet hos de drabbade mössen, kan det ursprungliga syftet att modellera bröstcancer hos dessa möss vara förbjudet (t. ex. kan Mmtv-CRE-drivna onkogena händelser leda till hematopoietiska maligniteter och tidig död hos möss , på grund av läckage av Mmtv promotorn i hematopoietiska celler)4.
Här rapporterar vi en modell bröstcancer modellering i möss som tillåter både cell-typ-och organspecifik manipulation av onkogena händelser i ett temporally kontrollerat sätt. Detta tillvägagångssätt är baserat på en intraduktalt injektion av AD-CRE i mus MGS (och är, sålunda, organspecifika). CRE-uttrycket kan kontrolleras med hjälp av olika MEC-specifika projektansvariga som är inbäddade i adenovirala vektor (t. ex. Krt8 för luminala-mecs, Krt5 för basala mecs, vilket uppnår cell typs specificitet). Cancer induktion i MGs kan vara temporally kontrolleras av en injektion av AD-CRE i möss i olika åldrar, med början från 3-4 veckors ålder (pubertal) till vuxen stadiet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Framgången för detta tillvägagångssätt för att inducera brösttumörer från olika subpopulationer av mecs förlitar sig inte bara på att välja lämpliga cell-typ-specifika initiativtagare (för att driva CRE uttryck) men också på intraduktalt injektionsproceduren själv. Tanken bakom detta tillvägagångssätt är att de injicerade AD-CRE virus bevaras i duktal trädet, som är en dold struktur med lumen, och därför är endast mecs utsätts för virus och är smittade av AD-CRE. På grund av den begränsade …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (NIH) Grant R01 CA222560 och av Department of Defense genombrott Award W81XWH-18-1-0037.
Materials
| 33-gauge needle | Hamilton | 7803-05 | point style 3 blunt |
| 7mm Reflex Clip | Braintree Scientific | RF7 CS | |
| Adenovirus, Ad-K5-Cre | University of Iowa Viral Vector Core | Ad5-bk5-Cre (VVC-Berns-1547) | |
| Adenovirus, Ad-K8-Cre | University of Iowa Viral Vector Core | Ad5mK8-nlsCre | |
| Alcohol | Fisher | HC800-1GAL | Prepare to 70% in use |
| biotinylated CD31 | eBiosciences | 13-0311-85 | |
| biotinylated CD45 | eBiosciences | 13-0451-85 | |
| biotinylated TER119 | eBiosciences | 13-5921-85 | |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| CD24-AF-700 | BD Pharmingen | 564237 | |
| CD24-PE | eBiosciences | 12-0242-83 | |
| CD29-APC | eBiosciences | 17-0291-82 | |
| CD29-PE | eBiosciences | 12-0291-82 | |
| Hair Remover Lotion | Nair | 9 Oz | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 7636-01 | 0.025 mL |
| Iodophors | Betadine | 10% Povidone-iodine | |
| Isoflurane | Baxter | NDC 10019-360-40 | 1-2.5% |
| Loxicam | Norbrook | NDC 55529-040-10 | 5 mg/ml |
| Lubricant Eye Ointment | Akorn | NDC 17478-062-35 | |
| Micro-dissecting scissors | Pentair | 9M | Watchmaker's Forceps |
| Micro-dissecting tweezers | Dumont | M5 | |
| Taq 5X Master Mix | New England Biolabs | M0285L | |
References
- Wagner, K. U., et al. Cre-mediated gene deletion in the mammary gland. Nucleic Acids Research. 25 (21), 4323-4330 (1997).
- Selbert, S., et al. Efficient BLG-Cre mediated gene deletion in the mammary gland. Transgenic Research. 7 (5), 387-396 (1998).
- Jonkers, J., et al. Synergistic tumor suppressor activity of BRCA2 and p53 in a conditional mouse model for breast cancer. Nature Genetics. 29 (4), 418-425 (2001).
- van Bragt, M. P., Hu, X., Xie, Y., Li, Z. RUNX1, a transcription factor mutated in breast cancer, controls the fate of ER-positive mammary luminal cells. eLife. 3, e03881 (2014).
- Tao, L., van Bragt, M. P., Li, Z. A Long-Lived Luminal Subpopulation Enriched with Alveolar Progenitors Serves as Cellular Origin of Heterogeneous Mammary Tumors. Stem Cell Reports. 5 (1), 60-74 (2015).
- Xu, X., et al. Conditional mutation of Brca1 in mammary epithelial cells results in blunted ductal morphogenesis and tumour formation. Nature Genetics. 22 (1), 37-43 (1999).
- Li, Z., et al. ETV6-NTRK3 fusion oncogene initiates breast cancer from committed mammary progenitors via activation of AP1 complex. Cancer Cell. 12 (6), 542-558 (2007).
- Liu, X., et al. Somatic loss of BRCA1 and p53 in mice induces mammary tumors with features of human BRCA1-mutated basal-like breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (29), 12111-12116 (2007).
- Molyneux, G., et al. BRCA1 basal-like breast cancers originate from luminal epithelial progenitors and not from basal stem cells. Cell Stem Cell. 7 (3), 403-417 (2010).
- Koren, S., et al. PIK3CA induces multipotency and multi-lineage mammary tumours. Nature. 525 (7567), 114-118 (2015).
- Van Keymeulen, A., et al. Reactivation of multipotency by oncogenic PIK3CA induces breast tumour heterogeneity. Nature. 525 (7567), 119-123 (2015).
- Tao, L., Xiang, D., Xie, Y., Bronson, R. T., Li, Z. Induced p53 loss in mouse luminal cells causes clonal expansion and development of mammary tumours. Nature Communications. 8, 14431 (2017).
- Tao, L., van Bragt, M. P. A., Laudadio, E., Li, Z. Lineage Tracing of Mammary Epithelial Cells Using Cell-Type-Specific Cre-Expressing Adenoviruses. Stem Cell Reports. 2 (6), 770-779 (2014).
- Sutherland, K. D., et al. Cell of origin of small cell lung cancer: inactivation of Trp53 and Rb1 in distinct cell types of adult mouse lung. Cancer Cell. 19 (6), 754-764 (2011).
- Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
- The Cancer Genome Atlas Network. Comprehensive molecular portraits of human breast tumours. Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).
- Nik-Zainal, S., et al. The life history of 21 breast cancers. Cell. 149 (5), 994-1007 (2012).
- Abba, M. C., et al. A Molecular Portrait of High-Grade Ductal Carcinoma In Situ. Cancer Research. 75 (18), 3980-3990 (2015).
