دراسة سمية الجسيمات النانوية أكسيد الزنك في ثقافة الخلية وفي Drosophila melanogaster
Summary
نحن نصف بروتوكول مفصل لتقييم الملامح السمية للجسيمات النانوية أكسيد الزنك (ZnO NPs) على وجه الخصوص، ونوع موت الخلايا في الخلايا البشرية MRC5 الخلايا الليفية وتشكيل ROS في ذبابة الفاكهة Drosophila.
Abstract
الجسيمات النانوية أكسيد الزنك (ZnO NPs) لديها مجموعة واسعة من التطبيقات، ولكن عدد التقارير عن السمية المرتبطة NP ZnO نمت بسرعة في السنوات الأخيرة. ومع ذلك، فإن الدراسات التي توضح الآليات الأساسية للسمية الناجمة عن NP ZnO ضئيلة. حددنا ملامح سمية ZnO NPs باستخدام كل من في المختبر وفي النماذج التجريبية في الجسم الحي. ولوحظ انخفاض كبير في قدرة الخلايا على البقاء في الخلايا التي تتعرض لها الخلايا المضادة للخلايا من قبل شركة ZNO والخلايا الليفية الرئوية من قبل شركة MRC5، مما يدل على أن الـ ZnO NPs تمارس تأثيرات سامة للخلايا. وبالمثل، من المثير للاهتمام، القناة الهضمية المعرضة لZnO NPs أظهرت زيادة كبيرة في مستويات أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) في ذبابة الفاكهة دروسوفيلا. ويلزم إجراء المزيد من الدراسات المتعمقة لإجراء تقييم للمخاطر من أجل زيادة استخدام المستهلكين للملوثات غير المنخفضة من النينيو.
Introduction
تشير تقنية النانو إلى تطبيق المواد النانوية التي تستخدم في جميع المجالات العلمية، بما في ذلك الطب وعلوم المواد والكيمياء الحيوية. على سبيل المثال، يتم استخدام NPs ZnO المعروفة بتشتت الأشعة فوق البنفسجية، والاستشعار الكيميائي، والخصائص المضادة للميكروبات، فضلا عن الموصلية الكهربائية العالية، في إنتاج مختلف المنتجات الاستهلاكية مثل تغليف المواد الغذائية، ومستحضرات التجميل، المنسوجات والمطاط والبطاريات، ومحفز لمعالجة غاز الذيل السيارات، والتطبيقات الطبية الحيوية ذات الصلة1،2،3.
ومع ذلك، فإن التطبيقات المتنامية للمنتجات القائمة على NP ZnO، مما أدى إلى زيادة تعرض الإنسان للNO NPs، أثارت مخاوف بشأن آثارها السلبية المحتملة على صحة الإنسان. وقد أظهر عدد من الدراسات الخلوية في المختبر أن NPs ZnO يمكن أن تحفز الإجهاد التأكسدي، والسمية الخلوية المتصلة autophagy، التهاب، والسمية الجينية4،5،6،7،8 . وتجدر الإشارة إلى أن سمية الـ ZnO NPs يفترض أنها ناجمة عن انحلال الزنك لتحرير أيونات زن2+ ، وكذلك التفاعل السطحي لZnO ، مما يؤدي إلى الاختلالات الأيونية والأيضية الخلوية التي ترتبط بضعف التوازن الأيوني واختلال التوازن الأيوني واختلال التوازن الأيوني وخلل في التوازن الأيوني و تثبيط النقل أيون4،7،9،10. والأهم من ذلك، أظهرت الدراسات أن توليد أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) هو إحدى الآليات الرئيسية الكامنة وراء السمية المرتبطة بـ ZnO NPs. وقد ثبت عدم كفاية النشاط المضاد للأكسدة بعد إهانة ROS لتكون مسؤولة عن الحصول على السمية الخلوية وتلف الحمض النووي9. كما تم الإبلاغ عن الآثار السامة للNPs ZnO في النماذج الحيوانية، بما في ذلك القوارض1،حمار وحشي11،12،فضلا عن اللافقاريات Drosophila13.
Drosophila بمثابة نموذج حيواني بديل راسخلفحص السمية للكيانات الكيميائية والمواد النانوية (NMs)14،15. الأهم من ذلك، هناك مستويات عالية من التشابه الوراثي والفسيولوجي بين الإنسان وDrosophila التي تبرر استخدام Drosophila كنموذج في الجسم الحي لتقييم الاستجابات البيولوجية للملوثات البيئية مثل NMs 16.وعلاوة على ذلك، هناك العديد من المزايا لاستخدام Drosophila بسبب صغر حجمها، وعمرها القصير، والقدرة على الصيانة الوراثية، وصيانة سهلة وفعالة من حيث التكلفة. وعلاوة على ذلك، تم اعتماد دروسوفيلا على نطاق واسع لدراسة علم الوراثة، والبيولوجيا الجزيئية والتنموية، منذ أن تم تسلسل الجينوم الكامل قبل سنوات في عام 2000، مما يجعلها مناسبة لمجموعة متنوعة من الفرز عالية الإنتاجية ولمعالجة المسائل البيولوجية التي لم تحل17و18و19و20و21. في السنوات الأخيرة، تم الإبلاغ عن عدد من الدراسات المتعلقة بالسمية المناعية باستخدام أنواع مختلفة من الملوثات غير الالحكومية الوطنية في دروسوفيلا 15،22،23،24. وقد ساعدت هذه المعرفة الأساسية الجديدة التي تم الحصول عليها من الدراسات باستخدام Drosophila لتوفير المزيد من الرؤى في فهمنا للسمية النانوية.
ROS هو الجاني المعروف للسمية الخلوية والسمية الجينية الناجمة عن NPs، وعلى وجه الخصوص، NPs القائمة على المعادن25. ROS هي الأنواع الكيميائية التي تحتوي على الأكسجين مع خصائص رد الفعل أعلى من الأكسجين الجزيئي. الجذور الحرة مثل الجذر فوق أكسيد (O2–) وحتى، الجزيئات غير الراديكالية مثل بيروكسيد الهيدروجين (H2O2)يمكن أن تكون بمثابة ROS. في ظل الحالة الفسيولوجية العادية، ومطلوب منهم للحفاظ على التوازن الخلوي26،ومع ذلك، ROS المفرط ة بسبب الإفراط في الإنتاج أو خلل تنظيم نظام الدفاع المضادة للأكسدة يمكن أن يسبب الإجهاد التأكسدي، مما يؤدي إلى تلف البروتينات، الدهون وحمض ديوكسيريبونوكليك (DNA)27. على سبيل المثال، مع زيادة مستويات ROS وانخفاض مستوى الجلوتاثيون (GSH) في وقت واحد، يحدث اضطراب الأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) ويرتفع مستوى اللاكتات dehydrogenase (LDH) في المتوسط، وبلغت ذروتها في موت الخلايا27.
هنا، نحن نقدم بروتوكولات لإجراء التحليلات الخلوية والوراثية باستخدام خلايا الثدييات المستزرعة ودروسوفيلا لتحديد الآثار السلبية المحتملة للNO NPs. ويرد في الشكل 1لمحة عامة عن الطريقة المستخدمة في دراسة سمية الملوثات غير السمية لـ ZnO.
Protocol
Representative Results
Discussion
من أجل تقييم ما إذا كان ZnO NP يمكن أن تحفز المبرمج في الخلايا الليفية MRC5، ونحن نستخدم قياس التدفق للتمييز بين الخلايا من موت الخلايا النخرية أو المبرمج. في الخلايا الحية العادية ، يتم توطين فوسفاتيديلسيرين (PS) في غشاء الخلية. في حالة حدوث المبرمج، يتم نقل PS إلى النشرة خارج الخلية من غشاء البل?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم الدراسة من قبل رقم المنحة R706-000-043-490. ولا تمثل الدراسة رأي مقدم المنحة.
Materials
| 15% Methyl 4-Hydroxybenzoate | Sigma Aldrich | ||
| 4% Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Bacto Agar | BD biosciences | ||
| cncCK6/TM3, Sb | a gift from Dr. Kerppola T | ||
| cornmeal, glucose, yeast brewer | Sigma Aldrich | ||
| CyAn ADP with Summit Software | DAKO | https://flow.usc.edu/files/2014/07/BC-Cyan-ADP-User-Guide-2016.pdf | |
| Dihydroethidium (Hydroethidine) | Thermo Fisher Scientific | D11347 | |
| FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD biosciences | 556547 | |
| Fluorescent microscope | Olympus | ||
| Glucolin | Supermarket | ||
| Image J software | NIH | ||
| MRC5 human lung fibroblast | ATCC | CCL-171 | |
| Schneider’s Drosophila medium | Thermo Fisher Scientific | 21720-024 | |
| vectashield antifade mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| wild- type Canton-S; Sod2N308/CyO | NIG-FLY | ||
| Zinc Oxide Nanoparticles | Sigma Aldrich | 721077 | Refer Sheet 2 |
References
- Kim, Y. R., et al. Toxicity of 100 nm zinc oxide nanoparticles: a report of 90-day repeated oral administration in Sprague Dawley rats. International Journal of Nanomedicine. 9 Suppl 2, 109-126 (2014).
- Xie, Y., He, Y., Irwin, P. L., Jin, T., Shi, X. Antibacterial activity and mechanism of action of zinc oxide nanoparticles against Campylobacter jejuni. Applied and Environmental Microbiology. 77, 2325-2331 (2011).
- Colvin, V. L. The potential environmental impact of engineered nanomaterials. Nature Biotechnology. 21, 1166-1170 (2003).
- De Angelis, I., et al. Comparative study of ZnO and TiO(2) nanoparticles: physicochemical characterisation and toxicological effects on human colon carcinoma cells. Nanotoxicology. 7, 1361-1372 (2013).
- Johnson, B. M., et al. Acute exposure to ZnO nanoparticles induces autophagic immune cell death. Nanotoxicology. 9, 737-748 (2015).
- Singh, N., et al. NanoGenotoxicology: the DNA damaging potential of engineered nanomaterials. Biomaterials. 30, 3891-3914 (2009).
- Song, W., et al. Role of the dissolved zinc ion and reactive oxygen species in cytotoxicity of ZnO nanoparticles. Toxicology Letters. 199, 389-397 (2010).
- Wahab, R., et al. ZnO nanoparticles induced oxidative stress and apoptosis in HepG2 and MCF-7 cancer cells and their antibacterial activity. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 117, 267-276 (2014).
- Namvar, F., et al. Cytotoxic effects of biosynthesized zinc oxide nanoparticles on murine cell lines. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2015, (2015).
- Wong, S. W., Leung, P. T., Djurisic, A. B., Leung, K. M. Toxicities of nano zinc oxide to five marine organisms: influences of aggregate size and ion solubility. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 396, 609-618 (2010).
- Hua, J., Vijver, M. G., Richardson, M. K., Ahmad, F., Peijnenburg, W. J. Particle-specific toxic effects of differently shaped zinc oxide nanoparticles to zebrafish embryos (Danio rerio). Environmental Toxicology and Chemistry. 33, 2859-2868 (2014).
- Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish. Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).
- Alaraby, M., Annangi, B., Hernandez, A., Creus, A., Marcos, R. A comprehensive study of the harmful effects of ZnO nanoparticles using Drosophila melanogaster as an in vivo model. Journal of Hazardous Materials. 296, 166-174 (2015).
- Rand, M. D. Drosophotoxicology: the growing potential for Drosophila in neurotoxicology. Neurotoxicology and Teratology. 32, 74-83 (2010).
- Ong, C., Yung, L. Y., Cai, Y., Bay, B. H., Baeg, G. H. Drosophila melanogaster as a model organism to study nanotoxicity. Nanotoxicology. 9, 396-403 (2015).
- Hoffmann, J. A., Reichhart, J. M. Drosophila innate immunity: an evolutionary perspective. Nature Immunology. 3, 121-126 (2002).
- Hughes, T. T., et al. Drosophila as a genetic model for studying pathogenic human viruses. Virology. 423, 1-5 (2012).
- Jennings, B. H. Drosophila – a versatile model in biology & medicine. Materials Today. 14, 190-195 (2011).
- Adams, M. D., Sekelsky, J. J. From sequence to phenotype: reverse genetics in Drosophila melanogaster. Nature Reviews Genetics. 3, 189-198 (2002).
- Adams, M. D., et al. The genome sequence of Drosophila melanogaster. Science. 287, 2185-2195 (2000).
- Ong, C., et al. Silver nanoparticles disrupt germline stem cell maintenance in the Drosophila testis. Scientific Reports. 6, (2016).
- Alaraby, M., Demir, E., Hernandez, A., Marcos, R. Assessing potential harmful effects of CdSe quantum dots by using Drosophila melanogaster as in vivo model. Science of the Total Environment. 530-531, 66-75 (2015).
- Barik, B. K., Mishra, M. Nanoparticles as a potential teratogen: a lesson learnt from fruit fly. Nanotoxicology. , 1-27 (2018).
- Jovanovic, B., et al. The effects of a human food additive, titanium dioxide nanoparticles E171, on Drosophila melanogaster – a 20 generation dietary exposure experiment. Scientific Reports. 8, (2018).
- Cao, Y. The Toxicity of Nanoparticles to Human Endothelial Cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1048, 59-69 (2018).
- Akhtar, M. J., Ahamed, M., Alhadlaq, H. A., Alshamsan, A. Mechanism of ROS scavenging and antioxidant signalling by redox metallic and fullerene nanomaterials: Potential implications in ROS associated degenerative disorders. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1861, 802-813 (2017).
- Akter, M., et al. A systematic review on silver nanoparticles-induced cytotoxicity: Physicochemical properties and perspectives. Journal of Advanced Research. 9, 1-16 (2018).
- Vecchio, G. A fruit fly in the nanoworld: once again Drosophila contributes to environment and human health. Nanotoxicology. 9, 135-137 (2015).
- Marino, G., Kroemer, G. Mechanisms of apoptotic phosphatidylserine exposure. Cell Research. 23, 1247-1248 (2013).
- Stoddart, M. J. Cell Viability Assays: Introduction. Mammalian Cell Viability: Methods and Protocols. , (2011).
- Yazdani, M. Concerns in the application of fluorescent probes DCDHF-DA, DHR 123 and DHE to measure reactive oxygen species in vitro. Toxicology in Vitro. 30, 578-582 (2015).
- Chen, J., Rogers, S. C., Kavdia, M. Analysis of kinetics of dihydroethidium fluorescence with superoxide using xanthine oxidase and hypoxanthine assay. Annals of Biomedical Engineering. 41, 327-337 (2013).
- Hartig, S. M. Basic image analysis and manipulation in ImageJ. Current Protocols in Molecular Biology. , (2013).
