Исследование токсичности наночастиц оксида цинка в клеточной культуре и в Drosophila melanogaster
Summary
Мы описываем подробный протокол для оценки токсикологических профилей наночастиц оксида цинка (NO NPs), в частности, тип клеточной смерти в человеческих фибробластах легких MRC5 и образование ROS в плодовой мухе Drosophila.
Abstract
Наночастицы оксида цинка (NO NPs) имеют широкий спектр применений, но количество сообщений о токсичности, связанной с NP-ассоциированной деятельностью, в последние годы быстро растет. Тем не менее, исследования, которые разъясняют основные механизмы для NO NP-индуцированной токсичности скудны. Мы определили профили токсичности NP с использованием как in vitro, так и in vivo экспериментальных моделей. Значительное снижение жизнеспособности клеток наблюдалось в фибробластах легких MRC5, показывающих, что НП Зно оказывают цитотоксическое действие. Аналогичным образом, интересно, кишечник подвергается NO NPs выставлены резкое увеличение уровня реактивных видов кислорода (ROS) в плодовой мухи Drosophila. Необходимы более углубленные исследования для проведения оценки рисков для более широкого использования NP-нпо в н.п. потребителями.
Introduction
Нанотехнология относится к применению наноразмерных материалов, которые используются во всех научных областях, включая медицину, материаловедение и биохимию. Например, NO NPs, которые известны своими ультрафиолетовыми рассеяниями, химическим зондированием и антимикробными свойствами, а также высокой электрической проводимостью, используются в производстве различных потребительских товаров, таких как пищевая упаковка, косметика, текстиль, каучуки, аккумуляторы, катализатор для обработки автомобильным хвостом газа, и биомедицинскихприложений,связанных с 1,2,3.
Вместе с тем растущее применение продуктов на основе НП «Нена», что приводит к увеличению воздействия на людей НП Зно, вызывает обеспокоенность по поводу их потенциального неблагоприятного воздействия на здоровье человека. Ряд исследований в пробирке показали, что Нп., зно-О НП, могут вызывать окислительный стресс, аутофагию, цитотоксичность, воспаление и генотоксичность4,5,6,7,8 . Примечательно, что токсичность NO NPs, как предполагается, вызвана растворением ионов n, чтобы освободить ионы n2, а также поверхностной реактивностью «nO», что приводит к клеточной ионной и метаболическим дисбалансам, которые связаны с нарушением ионного гомеостаза и ингибирование ионного транспорта4,7,9,10. Важно отметить, что исследования показали, что генерация реактивных видов кислорода (ROS) является одним из основных механизмов, лежащих в основе NO NPs-ассоциированной токсичности. Недостаточная антиоксидативная активность после оскорбления ROS была доказана, чтобы нести ответственность за вырастая цитотоксичность и повреждение ДНК9. Токсическое воздействие NO NPs также были зарегистрированы в животных моделях, в том числе грызунов1, зебрафиш11,12, а также беспозвоночных Drosophila13.
Дрозофила служит в качестве устоявшейся альтернативной модели животных для скрининга токсичности химических веществ и наноматериалов (НМ)14,15. Важно отметить, что существует высокий уровень генетического и физиологического сходства между человеком и дрозофилой, что оправдывает использование дрозофилы в качестве модели in vivo для оценки биологических реакций на экологические загрязнители, такие как НМ 16. Кроме того, Есть много преимуществ использования Drosophila из-за его небольшой размер, короткий срок службы, генетические удобства, и легкои и экономически эффективное обслуживание. Кроме того, Drosophila была широко принята для изучения генетики, молекулярной и биологии развития, с тех пор его полный геном был полностью секвенирован лет назад в 2000 году, что делает его пригодным для различных высокой пропускной скрининг и для решения нерешенных биологических вопросов17,18,19,20,21. В последние годы, ряд исследований, связанных с иммунотоксичностью с использованием различных типов NPs в Drosophila были зарегистрированы15,22,23,24. Это фундаментальное новое знание, полученное в ходе исследований с использованием дрозофилы, помогло дать больше информации о нашем понимании нанотоксикологии.
ROS является известным виновником цитотоксичности и генотоксичности, вызванных НП, в частности, на основе металла NPs25. ROS являются кислородосодержащими химическими видами с более высокими реактивными свойствами, чем молекулярный кислород. Свободные радикалы, такие как супероксид радикальных (O2–) и даже, нерадикальные молекулы, такие как перекись водорода (H2O2) может выступать в качестве ROS. При нормальном физиологическом состоянии, они необходимы для поддержания клеточного гомеостаза26, однако, чрезмерное ROS из-за перепроизводства или дисрегуляции антиоксидантной системы защиты может вызвать окислительный стресс, что приводит к повреждению белков, липиды и дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК)27. Например, по мере повышения уровня ROS и снижения уровня глутатиона (ГСГ) одновременно происходит нарушение синтеза аденозинтрифосфата (АТФ), а уровень лактата дегидрогеназы (ЛПГ) повышается в среде, что приводит к гибели клеток27.
Здесь мы предоставляем протоколы для выполнения клеточного и генетического анализа с использованием культивированных клеток млекопитающих и дрозофилы для определения потенциальных побочных эффектов NO NPs. Обзор метода, используемого для исследования токсичности NPs, показан на рисунке 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Для того, чтобы оценить, если NO NP может вызвать апоптоз в фибробластах MRC5, мы используем цитометрию потока, чтобы отличить клетки от некротической или апоптотической смерти клеток. В нормальных живых клетках фосфатидилсерин (PS) локализован в клеточной мембране. При возникновении апопто…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Исследование было поддержано номером гранта R706-000-043-490. Исследование не отражает мнение спонсора гранта.
Materials
| 15% Methyl 4-Hydroxybenzoate | Sigma Aldrich | ||
| 4% Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Bacto Agar | BD biosciences | ||
| cncCK6/TM3, Sb | a gift from Dr. Kerppola T | ||
| cornmeal, glucose, yeast brewer | Sigma Aldrich | ||
| CyAn ADP with Summit Software | DAKO | https://flow.usc.edu/files/2014/07/BC-Cyan-ADP-User-Guide-2016.pdf | |
| Dihydroethidium (Hydroethidine) | Thermo Fisher Scientific | D11347 | |
| FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD biosciences | 556547 | |
| Fluorescent microscope | Olympus | ||
| Glucolin | Supermarket | ||
| Image J software | NIH | ||
| MRC5 human lung fibroblast | ATCC | CCL-171 | |
| Schneider’s Drosophila medium | Thermo Fisher Scientific | 21720-024 | |
| vectashield antifade mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| wild- type Canton-S; Sod2N308/CyO | NIG-FLY | ||
| Zinc Oxide Nanoparticles | Sigma Aldrich | 721077 | Refer Sheet 2 |
References
- Kim, Y. R., et al. Toxicity of 100 nm zinc oxide nanoparticles: a report of 90-day repeated oral administration in Sprague Dawley rats. International Journal of Nanomedicine. 9 Suppl 2, 109-126 (2014).
- Xie, Y., He, Y., Irwin, P. L., Jin, T., Shi, X. Antibacterial activity and mechanism of action of zinc oxide nanoparticles against Campylobacter jejuni. Applied and Environmental Microbiology. 77, 2325-2331 (2011).
- Colvin, V. L. The potential environmental impact of engineered nanomaterials. Nature Biotechnology. 21, 1166-1170 (2003).
- De Angelis, I., et al. Comparative study of ZnO and TiO(2) nanoparticles: physicochemical characterisation and toxicological effects on human colon carcinoma cells. Nanotoxicology. 7, 1361-1372 (2013).
- Johnson, B. M., et al. Acute exposure to ZnO nanoparticles induces autophagic immune cell death. Nanotoxicology. 9, 737-748 (2015).
- Singh, N., et al. NanoGenotoxicology: the DNA damaging potential of engineered nanomaterials. Biomaterials. 30, 3891-3914 (2009).
- Song, W., et al. Role of the dissolved zinc ion and reactive oxygen species in cytotoxicity of ZnO nanoparticles. Toxicology Letters. 199, 389-397 (2010).
- Wahab, R., et al. ZnO nanoparticles induced oxidative stress and apoptosis in HepG2 and MCF-7 cancer cells and their antibacterial activity. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 117, 267-276 (2014).
- Namvar, F., et al. Cytotoxic effects of biosynthesized zinc oxide nanoparticles on murine cell lines. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2015, (2015).
- Wong, S. W., Leung, P. T., Djurisic, A. B., Leung, K. M. Toxicities of nano zinc oxide to five marine organisms: influences of aggregate size and ion solubility. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 396, 609-618 (2010).
- Hua, J., Vijver, M. G., Richardson, M. K., Ahmad, F., Peijnenburg, W. J. Particle-specific toxic effects of differently shaped zinc oxide nanoparticles to zebrafish embryos (Danio rerio). Environmental Toxicology and Chemistry. 33, 2859-2868 (2014).
- Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish. Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).
- Alaraby, M., Annangi, B., Hernandez, A., Creus, A., Marcos, R. A comprehensive study of the harmful effects of ZnO nanoparticles using Drosophila melanogaster as an in vivo model. Journal of Hazardous Materials. 296, 166-174 (2015).
- Rand, M. D. Drosophotoxicology: the growing potential for Drosophila in neurotoxicology. Neurotoxicology and Teratology. 32, 74-83 (2010).
- Ong, C., Yung, L. Y., Cai, Y., Bay, B. H., Baeg, G. H. Drosophila melanogaster as a model organism to study nanotoxicity. Nanotoxicology. 9, 396-403 (2015).
- Hoffmann, J. A., Reichhart, J. M. Drosophila innate immunity: an evolutionary perspective. Nature Immunology. 3, 121-126 (2002).
- Hughes, T. T., et al. Drosophila as a genetic model for studying pathogenic human viruses. Virology. 423, 1-5 (2012).
- Jennings, B. H. Drosophila – a versatile model in biology & medicine. Materials Today. 14, 190-195 (2011).
- Adams, M. D., Sekelsky, J. J. From sequence to phenotype: reverse genetics in Drosophila melanogaster. Nature Reviews Genetics. 3, 189-198 (2002).
- Adams, M. D., et al. The genome sequence of Drosophila melanogaster. Science. 287, 2185-2195 (2000).
- Ong, C., et al. Silver nanoparticles disrupt germline stem cell maintenance in the Drosophila testis. Scientific Reports. 6, (2016).
- Alaraby, M., Demir, E., Hernandez, A., Marcos, R. Assessing potential harmful effects of CdSe quantum dots by using Drosophila melanogaster as in vivo model. Science of the Total Environment. 530-531, 66-75 (2015).
- Barik, B. K., Mishra, M. Nanoparticles as a potential teratogen: a lesson learnt from fruit fly. Nanotoxicology. , 1-27 (2018).
- Jovanovic, B., et al. The effects of a human food additive, titanium dioxide nanoparticles E171, on Drosophila melanogaster – a 20 generation dietary exposure experiment. Scientific Reports. 8, (2018).
- Cao, Y. The Toxicity of Nanoparticles to Human Endothelial Cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1048, 59-69 (2018).
- Akhtar, M. J., Ahamed, M., Alhadlaq, H. A., Alshamsan, A. Mechanism of ROS scavenging and antioxidant signalling by redox metallic and fullerene nanomaterials: Potential implications in ROS associated degenerative disorders. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1861, 802-813 (2017).
- Akter, M., et al. A systematic review on silver nanoparticles-induced cytotoxicity: Physicochemical properties and perspectives. Journal of Advanced Research. 9, 1-16 (2018).
- Vecchio, G. A fruit fly in the nanoworld: once again Drosophila contributes to environment and human health. Nanotoxicology. 9, 135-137 (2015).
- Marino, G., Kroemer, G. Mechanisms of apoptotic phosphatidylserine exposure. Cell Research. 23, 1247-1248 (2013).
- Stoddart, M. J. Cell Viability Assays: Introduction. Mammalian Cell Viability: Methods and Protocols. , (2011).
- Yazdani, M. Concerns in the application of fluorescent probes DCDHF-DA, DHR 123 and DHE to measure reactive oxygen species in vitro. Toxicology in Vitro. 30, 578-582 (2015).
- Chen, J., Rogers, S. C., Kavdia, M. Analysis of kinetics of dihydroethidium fluorescence with superoxide using xanthine oxidase and hypoxanthine assay. Annals of Biomedical Engineering. 41, 327-337 (2013).
- Hartig, S. M. Basic image analysis and manipulation in ImageJ. Current Protocols in Molecular Biology. , (2013).
