細胞培養およびショウジョウバエメラノガスターにおける酸化亜鉛ナノ粒子の毒性研究
Summary
特に酸化亜鉛ナノ粒子(ZnO NPs)の毒性プロファイルを評価するための詳細なプロトコルについて説明し、ヒトMRC5肺線維芽細胞における細胞死の種類および果実フライドロソフィラにおけるROS形成について説明する。
Abstract
酸化亜鉛ナノ粒子(ZnO NP)は幅広い用途を持っていますが、ZnO NP関連毒性に関する報告の数は近年急速に増加しています。しかし、ZnO NP誘発毒性の根本的なメカニズムを解明する研究はスキャン可能である。インビトロとインビボ実験モデルの両方を用いてZnO NPの毒性プロファイルを決定した。ZnO NP曝露MRC5肺線維芽細胞では細胞生存率の有意な減少が認され、ZnO NPが細胞傷害作用を発揮することを示した。同様に、興味深いことに、ZnO NPに曝露された腸は、フルーツフライショウジョウバエにおける活性酸素種レベル(ROS)の劇的な増加を示した。消費者によるZnO NPの使用率の増加に対するリスク評価を確立するためには、より詳細な研究が必要である。
Introduction
ナノテクノロジーとは、医学、材料科学、生化学など、あらゆる科学分野で使用されるナノサイズの材料の応用を指します。例えば、紫外線散乱、化学センシング、抗微生物性、高い電気伝導性で知られるZnO NPは、食品包装、化粧品など様々な消費財の製造に活用されています。繊維、ゴム、電池、自動車テールガス処理用触媒、および生物医学関連アプリケーション1、2、3.
しかし、ZnO NPベースの製品の急増は、ZnO NPへの人間の暴露の増加につながる、人間の健康に対する潜在的な悪影響に関する懸念を提起している。インビトロ細胞研究の数は、ZnO NPが酸化ストレス、オートファジー関連細胞毒性、炎症、および無毒性4、5、6、7、8を誘発できることを実証しました.特に、ZnO NPの毒性は、Zn2+イオンを自由に溶解し、ZnOの表面反応性によって引き起こされると仮定され、その結果、細胞イオン性および代謝不均衡が生じ、イオン性恒常性障害およびイオン輸送の阻害4,7,9,10.重要なことに、研究は、活性酸素種(ROS)の生成がZnO NPs関連毒性の基礎となる主要なメカニズムの一つであることを示しています。ROS侮辱後の不十分な抗酸化活性は、細胞毒性およびDNA損傷9を引き起こす原因であることが示されている。ZnO NPの毒性効果は、げっ歯類1、ゼブラフィッシュ11、12、ならびに無脊椎動物のショウジョウバエ13を含む動物モデルでも報告されている。
ショウジョウバエは、化学物質およびナノ材料(NM)14、15の毒性スクリーニングのための確立された代替動物モデルとして機能する。重要なのは、ヒトとショウジョウバエの間には高いレベルの遺伝的類似性があり、NMなどの環境汚染物質に対する生物学的応答を評価するための生体内モデルとしてのショウジョウバエの使用を正当化する。16.さらに、その小さなサイズ、短い寿命、遺伝的なアメニティ、および容易で、費用効果が大きい維持のためにショウジョウバエを使用することの多くの利点がある。さらに、ショウジョウバエは遺伝学、分子、発生生物学の研究に広く採用されており、2000年に完全なゲノムが完全に配列され、様々なハイスループットスクリーニングに適しています。そして、未解決の生物学的問題に取り組むために17,18,19,20,21.近年、ショウジョウバエにおける異なるタイプのNPを用いた免疫毒性に関する多くの研究が15、22、23、24で報告されている。ショウジョウバエを用いた研究から得られたこの基本的な新しい知識は、ナノトキシトロジーの理解に関するより多くの洞察を提供するのに役立ちました。
ROSは、特に、金属ベースのNP25によって引き起こされる細胞毒性および無毒性の既知の原因である。ROSは、分子酸素よりも高い活性特性を有する酸素含有化学種である。スーパーオキシドラジカル(O2-)などのフリーラジカルは、過酸化水素(H2O2)などの非ラジカル分子がROSとして作用しうる。正常な生理学的状態の下では、それらは細胞恒常性26を維持する必要があるが、抗酸化防御システムの過剰産生または不自由による過剰なROSは酸化ストレスを引き起こし、タンパク質への損傷を引き起こす可能性があり、脂質およびデオキシリボ核酸(DNA)27.例えば、ROSレベルが増加し、グルタチオン(GSH)レベルが伴って減少するにつれて、アデノシン三リン酸(ATP)合成の中断が起こり、乳酸脱水素酵素(LDH)レベルが培地中で増加し、細胞死27で終わる。
ここでは、培養哺乳動物細胞とショウジョウバエを用いて細胞解析や遺伝子解析を行い、ZnO NPの潜在的な悪影響を判定するプロトコルを提供する。ZnO NPの毒性試験に用いられる方法の概要を図1に示す。
Protocol
Representative Results
Discussion
ZnO NPがMRC5線維芽細胞にアポトーシスを誘導できるかどうかを評価するために、我々は細胞を壊死またはアポトーシス細胞死から区別するためにフローサイトメトリーを使用する。正常な生細胞では、ホスファチジルセリン(PS)は細胞膜に局在する。アポトーシスが発生した場合、PSは血漿膜の細胞外リーフレットに転移し、Fluoresin(FITCアネキシンV)29で標識されたアネキシンV?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
研究は、補助金番号R706-000-043-490によってサポートされました。このスタディは、補助金スポンサーのビューを表すものではありません。
Materials
| 15% Methyl 4-Hydroxybenzoate | Sigma Aldrich | ||
| 4% Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Bacto Agar | BD biosciences | ||
| cncCK6/TM3, Sb | a gift from Dr. Kerppola T | ||
| cornmeal, glucose, yeast brewer | Sigma Aldrich | ||
| CyAn ADP with Summit Software | DAKO | https://flow.usc.edu/files/2014/07/BC-Cyan-ADP-User-Guide-2016.pdf | |
| Dihydroethidium (Hydroethidine) | Thermo Fisher Scientific | D11347 | |
| FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD biosciences | 556547 | |
| Fluorescent microscope | Olympus | ||
| Glucolin | Supermarket | ||
| Image J software | NIH | ||
| MRC5 human lung fibroblast | ATCC | CCL-171 | |
| Schneider’s Drosophila medium | Thermo Fisher Scientific | 21720-024 | |
| vectashield antifade mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| wild- type Canton-S; Sod2N308/CyO | NIG-FLY | ||
| Zinc Oxide Nanoparticles | Sigma Aldrich | 721077 | Refer Sheet 2 |
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