Toksicitetsundersøgelse af zinkoxid nanopartikler i cellekultur og i Drosophila melanogaster
Summary
Vi beskriver en detaljeret protokol til evaluering af de toksikologiske profiler af zinkoxid nanopartikler (ZnO NPs) i særdeleshed, typen af celledød i humane MRC5 lunge fibroblaster og ROS dannelse i frugtflue Drosophila.
Abstract
Zinkoxid nanopartikler (ZnO NPs) har en bred vifte af applikationer, men antallet af rapporter om ZnO NP-associeret toksicitet er vokset hurtigt i de seneste år. Men, undersøgelser, der belyse de underliggende mekanismer for ZnO NP-induceret toksicitet er scanty. Vi fastsatte toksicitets profilerne for ZnO NPs ved hjælp af både in vitro-og in vivo-forsøgsmodeller. Et signifikant fald i cellernes levedygtighed blev observeret i ZnO NP-eksponerede MRC5 lunge fibroblaster, hvilket viste, at ZnO NPs udøver cytotoksiske virkninger. Tilsvarende, interessant, Gut udsat for ZnO NPs udstillet en dramatisk stigning i reaktive ilt arter niveauer (ROS) i frugtflue Drosophila. Der er behov for mere dybtgående undersøgelser for at fastlægge en risikovurdering for forbrugernes øgede brug af ZnO NPs.
Introduction
Nanoteknologi refererer til anvendelsen af nanodimensionale materialer, der anvendes på tværs af alle videnskabelige områder, herunder medicin, materialevidenskab, og biokemi. For eksempel, ZnO NPs, der er kendt for deres ultraviolet spredning, kemisk sensing, og anti-mikrobielle egenskaber, samt høj elektrisk ledningsevne, udnyttes i produktionen af forskellige forbrugerprodukter såsom fødevareemballage, kosmetik, tekstiler, gummi, batterier, katalysator til bil hale gas behandling, og biomedicinske-relaterede applikationer1,2,3.
De spirende anvendelser af ZnO NP-baserede produkter, som fører til øget menneskelig udsættelse for ZnO NPs, har imidlertid givet anledning til betænkeligheder med hensyn til deres potentielle skadelige virkninger på menneskers sundhed. En række in vitro cellulære undersøgelser har vist, at ZnO NPS kan inducere oxidativt stress, autophagy-relateret cytotoksicitet, inflammation og genotoksicitet4,5,6,7,8 . Især er toksiciteten af ZnO NP’er antaget at være forårsaget af opløsningen af Zn til frie Zn2 + ioner, samt overfladen reaktivitet af ZnO, hvilket resulterer i de cellulære Ioniske og metaboliske ubalancer, der er forbundet med nedsat ionisk homeostase og en hæmning af ion transport4,7,9,10. Det er vigtigt, at undersøgelser har vist, at genereringen af reaktive oxygenarter (ROS) er en af de primære mekanismer, der ligger til grund for ZnO NPs-associeret toksicitet. Utilstrækkelig anti-oxidativ aktivitet efter ROS fornærmelse har vist sig at være ansvarlig for at fremkalde cytotoksicitet og DNA-skade9. De toksiske virkninger af ZnO NPS er også blevet rapporteret i dyremodeller, herunder gnaver1, zebra11,12, samt hvirvelløse Drosophila13.
Drosophila fungerer som en veletableret alternativ dyremodel for toksicitets screening af kemiske enheder og nanomaterialer (NMS)14,15. Det er vigtigt, at der er høje niveauer af genetisk og fysiologisk lighed mellem mennesker og Drosophila , som berettiger brugen af Drosophila som en in vivo-model til vurdering af biologisk respons på miljøforurenende stoffer såsom NMS 16. Desuden er der mange fordele ved at bruge Drosophila på grund af sin lille størrelse, kort levetid, genetiske modtagelighed, og nem og omkostningseffektiv vedligeholdelse. Desuden, Drosophila er blevet bredt vedtaget for studiet af genetik, molekylær og udviklingsmæssige biologi, lige siden dens fulde genom var fuldt sekvenserede år siden tilbage i 2000, derfor gør det egnet til en bred vifte af High-gennemløb screening og for at tackle uløste biologiske spørgsmål17,18,19,20,21. I de seneste år, en række undersøgelser relateret til immuntoksicitet ved hjælp af forskellige typer af NPS i Drosophila er blevet rapporteret15,22,23,24. Denne grundlæggende nye viden indhentet fra undersøgelserne ved hjælp af Drosophila har bidraget til at give mere indsigt i vores forståelse af Nanotoksikologi.
ROS er en velkendt synder for cytotoksicitet og genotoksicitet forårsaget af NPs, især, metal-baserede NPs25. ROS er oxygen-holdige kemiske arter med højere reaktive egenskaber end Molekylær ilt. Frie radikaler såsom superoxid radikal (O2–) og endda, ikke-radikale molekyler såsom hydrogenperoxid (H2O2) kan fungere som ros. Under normale fysiologiske tilstand, de er forpligtet til at opretholde cellulære homøostase26, dog, overdreven ros på grund af overproduktion eller dysregulering af antioxidant forsvar system kan forårsage oxidativ stress, fører til beskadigelse af proteiner, lipiderne og deoxyribonucleinsyre (DNA)27. For eksempel, som ROS niveauer stigning og glutathion (GSH) niveau falder samtidig, afbrydelse af adenosin trifosfat (ATP) syntese finder sted og lactat dehydrogenase (LDH) niveau stigninger i mediet, kulminerende i celledød27.
Her tilbyder vi protokoller for at udføre cellulære og genetiske analyser ved hjælp af dyrkede pattedyrceller og Drosophila at bestemme de potentielle negative virkninger af ZnO NPS. Figur 1viser en oversigt over den metode, der er anvendt til toksicitetsstudiet af ZnO NPS.
Protocol
Representative Results
Discussion
For at vurdere om ZnO NP kan inducere apoptose i MRC5 fibroblaster, bruger vi flowcytometri til at skelne cellerne fra nekrotisk eller apoptotisk celledød. I normale levende celler, Phosphatidylserin (PS) er lokaliseret på cellemembranen. Hvis apoptose forekommer, er PS omplaceret til den ekstracellulære folder i plasma membranen, hvilket gør det muligt at binde Bilagin V mærket med fluorescein (FITC Bilagin V)29. På den anden side er det røde fluorescerende propidium kaliumiodid (PI), et n…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Undersøgelsen blev støttet af tilskuds nummeret R706-000-043-490. Undersøgelsen repræsenterer ikke tilskuds sponsorens opfattelse.
Materials
| 15% Methyl 4-Hydroxybenzoate | Sigma Aldrich | ||
| 4% Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Bacto Agar | BD biosciences | ||
| cncCK6/TM3, Sb | a gift from Dr. Kerppola T | ||
| cornmeal, glucose, yeast brewer | Sigma Aldrich | ||
| CyAn ADP with Summit Software | DAKO | https://flow.usc.edu/files/2014/07/BC-Cyan-ADP-User-Guide-2016.pdf | |
| Dihydroethidium (Hydroethidine) | Thermo Fisher Scientific | D11347 | |
| FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD biosciences | 556547 | |
| Fluorescent microscope | Olympus | ||
| Glucolin | Supermarket | ||
| Image J software | NIH | ||
| MRC5 human lung fibroblast | ATCC | CCL-171 | |
| Schneider’s Drosophila medium | Thermo Fisher Scientific | 21720-024 | |
| vectashield antifade mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| wild- type Canton-S; Sod2N308/CyO | NIG-FLY | ||
| Zinc Oxide Nanoparticles | Sigma Aldrich | 721077 | Refer Sheet 2 |
References
- Kim, Y. R., et al. Toxicity of 100 nm zinc oxide nanoparticles: a report of 90-day repeated oral administration in Sprague Dawley rats. International Journal of Nanomedicine. 9 Suppl 2, 109-126 (2014).
- Xie, Y., He, Y., Irwin, P. L., Jin, T., Shi, X. Antibacterial activity and mechanism of action of zinc oxide nanoparticles against Campylobacter jejuni. Applied and Environmental Microbiology. 77, 2325-2331 (2011).
- Colvin, V. L. The potential environmental impact of engineered nanomaterials. Nature Biotechnology. 21, 1166-1170 (2003).
- De Angelis, I., et al. Comparative study of ZnO and TiO(2) nanoparticles: physicochemical characterisation and toxicological effects on human colon carcinoma cells. Nanotoxicology. 7, 1361-1372 (2013).
- Johnson, B. M., et al. Acute exposure to ZnO nanoparticles induces autophagic immune cell death. Nanotoxicology. 9, 737-748 (2015).
- Singh, N., et al. NanoGenotoxicology: the DNA damaging potential of engineered nanomaterials. Biomaterials. 30, 3891-3914 (2009).
- Song, W., et al. Role of the dissolved zinc ion and reactive oxygen species in cytotoxicity of ZnO nanoparticles. Toxicology Letters. 199, 389-397 (2010).
- Wahab, R., et al. ZnO nanoparticles induced oxidative stress and apoptosis in HepG2 and MCF-7 cancer cells and their antibacterial activity. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 117, 267-276 (2014).
- Namvar, F., et al. Cytotoxic effects of biosynthesized zinc oxide nanoparticles on murine cell lines. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2015, (2015).
- Wong, S. W., Leung, P. T., Djurisic, A. B., Leung, K. M. Toxicities of nano zinc oxide to five marine organisms: influences of aggregate size and ion solubility. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 396, 609-618 (2010).
- Hua, J., Vijver, M. G., Richardson, M. K., Ahmad, F., Peijnenburg, W. J. Particle-specific toxic effects of differently shaped zinc oxide nanoparticles to zebrafish embryos (Danio rerio). Environmental Toxicology and Chemistry. 33, 2859-2868 (2014).
- Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish. Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).
- Alaraby, M., Annangi, B., Hernandez, A., Creus, A., Marcos, R. A comprehensive study of the harmful effects of ZnO nanoparticles using Drosophila melanogaster as an in vivo model. Journal of Hazardous Materials. 296, 166-174 (2015).
- Rand, M. D. Drosophotoxicology: the growing potential for Drosophila in neurotoxicology. Neurotoxicology and Teratology. 32, 74-83 (2010).
- Ong, C., Yung, L. Y., Cai, Y., Bay, B. H., Baeg, G. H. Drosophila melanogaster as a model organism to study nanotoxicity. Nanotoxicology. 9, 396-403 (2015).
- Hoffmann, J. A., Reichhart, J. M. Drosophila innate immunity: an evolutionary perspective. Nature Immunology. 3, 121-126 (2002).
- Hughes, T. T., et al. Drosophila as a genetic model for studying pathogenic human viruses. Virology. 423, 1-5 (2012).
- Jennings, B. H. Drosophila – a versatile model in biology & medicine. Materials Today. 14, 190-195 (2011).
- Adams, M. D., Sekelsky, J. J. From sequence to phenotype: reverse genetics in Drosophila melanogaster. Nature Reviews Genetics. 3, 189-198 (2002).
- Adams, M. D., et al. The genome sequence of Drosophila melanogaster. Science. 287, 2185-2195 (2000).
- Ong, C., et al. Silver nanoparticles disrupt germline stem cell maintenance in the Drosophila testis. Scientific Reports. 6, (2016).
- Alaraby, M., Demir, E., Hernandez, A., Marcos, R. Assessing potential harmful effects of CdSe quantum dots by using Drosophila melanogaster as in vivo model. Science of the Total Environment. 530-531, 66-75 (2015).
- Barik, B. K., Mishra, M. Nanoparticles as a potential teratogen: a lesson learnt from fruit fly. Nanotoxicology. , 1-27 (2018).
- Jovanovic, B., et al. The effects of a human food additive, titanium dioxide nanoparticles E171, on Drosophila melanogaster – a 20 generation dietary exposure experiment. Scientific Reports. 8, (2018).
- Cao, Y. The Toxicity of Nanoparticles to Human Endothelial Cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1048, 59-69 (2018).
- Akhtar, M. J., Ahamed, M., Alhadlaq, H. A., Alshamsan, A. Mechanism of ROS scavenging and antioxidant signalling by redox metallic and fullerene nanomaterials: Potential implications in ROS associated degenerative disorders. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1861, 802-813 (2017).
- Akter, M., et al. A systematic review on silver nanoparticles-induced cytotoxicity: Physicochemical properties and perspectives. Journal of Advanced Research. 9, 1-16 (2018).
- Vecchio, G. A fruit fly in the nanoworld: once again Drosophila contributes to environment and human health. Nanotoxicology. 9, 135-137 (2015).
- Marino, G., Kroemer, G. Mechanisms of apoptotic phosphatidylserine exposure. Cell Research. 23, 1247-1248 (2013).
- Stoddart, M. J. Cell Viability Assays: Introduction. Mammalian Cell Viability: Methods and Protocols. , (2011).
- Yazdani, M. Concerns in the application of fluorescent probes DCDHF-DA, DHR 123 and DHE to measure reactive oxygen species in vitro. Toxicology in Vitro. 30, 578-582 (2015).
- Chen, J., Rogers, S. C., Kavdia, M. Analysis of kinetics of dihydroethidium fluorescence with superoxide using xanthine oxidase and hypoxanthine assay. Annals of Biomedical Engineering. 41, 327-337 (2013).
- Hartig, S. M. Basic image analysis and manipulation in ImageJ. Current Protocols in Molecular Biology. , (2013).
