Toksisitet studie av sink oksid nanopartikler i Cell kultur og i Drosophila melanogaster
Summary
Vi beskriver en detaljert protokoll for evaluering av toksikologiske profiler av sink oksid nanopartikler (ZnO NPs) spesielt, den type celle død i humant MRC5 lunge fibroblaster og ROS formasjon i frukten fly Drosophila.
Abstract
Sink oksid nanopartikler (ZnO NPs) har et bredt spekter av applikasjoner, men antall rapporter om ZnO NP-assosiert toksisitet har vokst raskt de siste årene. Men studier som belyse den underliggende mekanismer for ZnO NP-indusert toksisitet er sparsom. Vi bestemte toksisitet profilene til ZnO NPs ved hjelp av både in vitro og in vivo eksperimentelle modeller. En signifikant reduksjon i celle levedyktighet ble observert i ZnO NP-eksponert MRC5 lunge fibroblaster, som viser at ZnO NPs utøver cytotoksisk effekter. Tilsvarende interessant, gut eksponert for ZnO NPs utstilt en dramatisk økning i reaktive oksygen arter nivåer (ROS) i frukten fly Drosophila. Mer dyptgående studier er nødvendig for å etablere en risikovurdering for økt bruk av ZnO NPs av forbrukerne.
Introduction
Nanoteknologi refererer til anvendelse av nanosized materialer som brukes på tvers av alle vitenskapelige felt, inkludert medisin, materialer vitenskap, og biokjemi. For eksempel, ZnO NPs som er kjent for sine ultrafiolett spredning, kjemisk sensing, og anti-mikrobielle egenskaper, samt høy elektrisk ledningsevne, benyttes i produksjonen av ulike forbrukerprodukter som mat emballasje, kosmetikk, tekstil, gummi, batterier, katalysator for bil hale gass behandling, og biomedisinsk-relaterte applikasjoner1,2,3.
Men den spirende anvendelser av ZnO NP-baserte produkter, som fører til økt menneskelig eksponering for ZnO NPs, har reist bekymringer på sine potensielle bivirkninger på menneskers helse. En rekke in vitro Cellular studier har vist at ZnO NPs kan indusere oksidativt stress, autofagi-relatert cytotoksisitet, betennelser, og gentoksisitet4,5,6,7,8 . Spesielt er toksisitet av ZnO NPs antas å være forårsaket av oppløsningen av Zn å frigjøre Zn2 + ioner, samt overflaten reaktivitet av ZnO, noe som resulterer i mobilnettet ioniske og metabolske ubalanser som er knyttet til nedsatt ioniske homeostase og en Hemming av ion transport4,7,9,10. Viktigere, studier har vist at generering av reaktive oksygen arter (ROS) er en av de viktigste mekanismene underliggende ZnO NPs-assosiert toksisitet. Utilstrekkelig anti-oksidativt aktivitet etter ROS fornærmelse har vist å være ansvarlig for fremlokkende av cytotoksisitet og DNA-skade9. Den toksiske effekter av ZnO NPs har også blitt rapportert i dyremodeller, inkludert gnager1, sebrafisk11,12, så vel som virvelløse Drosophila13.
Drosophila fungerer som en veletablert alternativ dyremodell for toksisitet screening av kjemiske enheter og nanomaterialer (NMs)14,15. Det er viktig at det er høye nivåer av genetisk og fysiologisk likhet mellom menneske og Drosophila som rettferdiggjør bruken av Drosophila som en in vivo-modell for å evaluere biologiske reaksjoner på miljøgifter som NMs 16. Videre er det mange fordeler med å bruke Drosophila grunn av sin lille størrelse, kortlevetid, genetisk amenability, og enkelt og kostnadseffektivt vedlikehold. Dess, Drosophila har vært allment vedtatt for studiet av genetikk, molekylær og utviklingsmessige biologi, helt siden dens fulle Genova var fullt sekvensielt år siden tilbake i 2000, derfor gjør den egnet for en rekke høy gjennomstrømming screening og for å takle uløste biologiske spørsmål17,18,19,20,21. I de senere årene har en rekke studier knyttet til immunotoxicity med ulike typer NPs i Drosophila blitt rapportert15,22,23,24. Denne grunnleggende nye kunnskapen innhentet fra studiene ved hjelp av Drosophila har bidratt til å gi mer innsikt i vår forståelse av nanotoxicology.
ROS er en velkjent skyldige for cytotoksisitet og gentoksisitet forårsaket av NPs, spesielt metall-baserte NPs25. ROS er oksygen-inneholdende kjemiske arter med høyere reaktive egenskaper enn molekylær oksygen. Frie radikaler som superoxide radikale (O2–) og til og med, ikke-radikale molekyler som hydrogen peroxide (H2O2) kan fungere som ros. Under normale fysiologiske tilstand, er de pålagt å opprettholde mobilnettet homeostase26, men overdreven ros på grunn av overproduksjon eller feilregulering av antioksidant forsvar systemet kan forårsake oksidativt stress, fører til skade på proteiner, lipider og deoksyribonukleinsyre syre (DNA)27. For eksempel, som ROS nivåer øke og glutation (GSH) nivået avtar samtidig, forstyrrelse av adenosin trifosfat (ATP) syntese finner sted og melkesyre dehydrogenase (LDH) nivået øker i mediet, som kulminerte i celle død27.
Her gir vi protokoller for å utføre cellulære og genetiske analyser ved hjelp av kulturperler pattedyrceller og Drosophila å bestemme de potensielle bivirkningene av ZnO NPs. En oversikt over metoden som brukes for toksisitet studie av ZnO NPs er vist i figur 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
For å vurdere om ZnO NP kan indusere apoptose i MRC5 fibroblaster, bruker vi Flow flowcytometri å skille cellene fra nekrotisk eller apoptotisk celle død. I normale levende celler, fosfatidylserin (PS) er lokalisert på cellemembranen. Hvis apoptose oppstår, PS er translocated til ekstracellulære pakningsvedlegget av plasma membranen, slik at bindingen av Annexin V merket med fluorescein (FITC Annexin V)29. På den annen side, er den røde-fluorescerende propidium iodide (PI), en nukleinsyre …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Studien ble støttet av stipend nummer R706-000-043-490. Studien representerer ikke visningen av stipend sponsoren.
Materials
| 15% Methyl 4-Hydroxybenzoate | Sigma Aldrich | ||
| 4% Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Bacto Agar | BD biosciences | ||
| cncCK6/TM3, Sb | a gift from Dr. Kerppola T | ||
| cornmeal, glucose, yeast brewer | Sigma Aldrich | ||
| CyAn ADP with Summit Software | DAKO | https://flow.usc.edu/files/2014/07/BC-Cyan-ADP-User-Guide-2016.pdf | |
| Dihydroethidium (Hydroethidine) | Thermo Fisher Scientific | D11347 | |
| FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD biosciences | 556547 | |
| Fluorescent microscope | Olympus | ||
| Glucolin | Supermarket | ||
| Image J software | NIH | ||
| MRC5 human lung fibroblast | ATCC | CCL-171 | |
| Schneider’s Drosophila medium | Thermo Fisher Scientific | 21720-024 | |
| vectashield antifade mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| wild- type Canton-S; Sod2N308/CyO | NIG-FLY | ||
| Zinc Oxide Nanoparticles | Sigma Aldrich | 721077 | Refer Sheet 2 |
References
- Kim, Y. R., et al. Toxicity of 100 nm zinc oxide nanoparticles: a report of 90-day repeated oral administration in Sprague Dawley rats. International Journal of Nanomedicine. 9 Suppl 2, 109-126 (2014).
- Xie, Y., He, Y., Irwin, P. L., Jin, T., Shi, X. Antibacterial activity and mechanism of action of zinc oxide nanoparticles against Campylobacter jejuni. Applied and Environmental Microbiology. 77, 2325-2331 (2011).
- Colvin, V. L. The potential environmental impact of engineered nanomaterials. Nature Biotechnology. 21, 1166-1170 (2003).
- De Angelis, I., et al. Comparative study of ZnO and TiO(2) nanoparticles: physicochemical characterisation and toxicological effects on human colon carcinoma cells. Nanotoxicology. 7, 1361-1372 (2013).
- Johnson, B. M., et al. Acute exposure to ZnO nanoparticles induces autophagic immune cell death. Nanotoxicology. 9, 737-748 (2015).
- Singh, N., et al. NanoGenotoxicology: the DNA damaging potential of engineered nanomaterials. Biomaterials. 30, 3891-3914 (2009).
- Song, W., et al. Role of the dissolved zinc ion and reactive oxygen species in cytotoxicity of ZnO nanoparticles. Toxicology Letters. 199, 389-397 (2010).
- Wahab, R., et al. ZnO nanoparticles induced oxidative stress and apoptosis in HepG2 and MCF-7 cancer cells and their antibacterial activity. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 117, 267-276 (2014).
- Namvar, F., et al. Cytotoxic effects of biosynthesized zinc oxide nanoparticles on murine cell lines. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2015, (2015).
- Wong, S. W., Leung, P. T., Djurisic, A. B., Leung, K. M. Toxicities of nano zinc oxide to five marine organisms: influences of aggregate size and ion solubility. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 396, 609-618 (2010).
- Hua, J., Vijver, M. G., Richardson, M. K., Ahmad, F., Peijnenburg, W. J. Particle-specific toxic effects of differently shaped zinc oxide nanoparticles to zebrafish embryos (Danio rerio). Environmental Toxicology and Chemistry. 33, 2859-2868 (2014).
- Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish. Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).
- Alaraby, M., Annangi, B., Hernandez, A., Creus, A., Marcos, R. A comprehensive study of the harmful effects of ZnO nanoparticles using Drosophila melanogaster as an in vivo model. Journal of Hazardous Materials. 296, 166-174 (2015).
- Rand, M. D. Drosophotoxicology: the growing potential for Drosophila in neurotoxicology. Neurotoxicology and Teratology. 32, 74-83 (2010).
- Ong, C., Yung, L. Y., Cai, Y., Bay, B. H., Baeg, G. H. Drosophila melanogaster as a model organism to study nanotoxicity. Nanotoxicology. 9, 396-403 (2015).
- Hoffmann, J. A., Reichhart, J. M. Drosophila innate immunity: an evolutionary perspective. Nature Immunology. 3, 121-126 (2002).
- Hughes, T. T., et al. Drosophila as a genetic model for studying pathogenic human viruses. Virology. 423, 1-5 (2012).
- Jennings, B. H. Drosophila – a versatile model in biology & medicine. Materials Today. 14, 190-195 (2011).
- Adams, M. D., Sekelsky, J. J. From sequence to phenotype: reverse genetics in Drosophila melanogaster. Nature Reviews Genetics. 3, 189-198 (2002).
- Adams, M. D., et al. The genome sequence of Drosophila melanogaster. Science. 287, 2185-2195 (2000).
- Ong, C., et al. Silver nanoparticles disrupt germline stem cell maintenance in the Drosophila testis. Scientific Reports. 6, (2016).
- Alaraby, M., Demir, E., Hernandez, A., Marcos, R. Assessing potential harmful effects of CdSe quantum dots by using Drosophila melanogaster as in vivo model. Science of the Total Environment. 530-531, 66-75 (2015).
- Barik, B. K., Mishra, M. Nanoparticles as a potential teratogen: a lesson learnt from fruit fly. Nanotoxicology. , 1-27 (2018).
- Jovanovic, B., et al. The effects of a human food additive, titanium dioxide nanoparticles E171, on Drosophila melanogaster – a 20 generation dietary exposure experiment. Scientific Reports. 8, (2018).
- Cao, Y. The Toxicity of Nanoparticles to Human Endothelial Cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1048, 59-69 (2018).
- Akhtar, M. J., Ahamed, M., Alhadlaq, H. A., Alshamsan, A. Mechanism of ROS scavenging and antioxidant signalling by redox metallic and fullerene nanomaterials: Potential implications in ROS associated degenerative disorders. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1861, 802-813 (2017).
- Akter, M., et al. A systematic review on silver nanoparticles-induced cytotoxicity: Physicochemical properties and perspectives. Journal of Advanced Research. 9, 1-16 (2018).
- Vecchio, G. A fruit fly in the nanoworld: once again Drosophila contributes to environment and human health. Nanotoxicology. 9, 135-137 (2015).
- Marino, G., Kroemer, G. Mechanisms of apoptotic phosphatidylserine exposure. Cell Research. 23, 1247-1248 (2013).
- Stoddart, M. J. Cell Viability Assays: Introduction. Mammalian Cell Viability: Methods and Protocols. , (2011).
- Yazdani, M. Concerns in the application of fluorescent probes DCDHF-DA, DHR 123 and DHE to measure reactive oxygen species in vitro. Toxicology in Vitro. 30, 578-582 (2015).
- Chen, J., Rogers, S. C., Kavdia, M. Analysis of kinetics of dihydroethidium fluorescence with superoxide using xanthine oxidase and hypoxanthine assay. Annals of Biomedical Engineering. 41, 327-337 (2013).
- Hartig, S. M. Basic image analysis and manipulation in ImageJ. Current Protocols in Molecular Biology. , (2013).
