浮遊水耕システムにおけるアラビドプシス・タリアナ根の細菌の植民地化と維持のモニタリング
Summary
ここでは、種の存在を定量化し、植物の根の初期植民地化時および異なる成長環境への移動後の細菌の空間分布を可視化するための水耕植物成長アッセイについて説明する。
Abstract
細菌は、微生物、より大きな生物、および生物学的環境との相互作用によって形成された複雑な根茎圏微生物叢を形成する。実験室条件下では、植物成長促進細菌(PGPB)による根圏コロニー化は、未植民地化された植物に対する宿主植物の健康または発達を増加させることができる。しかし、フィールド設定では、PGPBによる細菌治療は、多くの場合、作物に実質的な利益を提供しません。1つの説明は、これは植物の寿命にわたって内因性土壌微生物との相互作用中にPGPBの損失に起因する可能性があることです。ほとんどの研究は、根茎群科内のPGPBの維持よりも初期の植民地化に焦点を当てているので、この可能性を確認することは困難でした。ここでは、細菌群集の組み立て、共存、維持は根圏微小環境の決定的特徴によって形成され、これらの相互作用がネイティブ環境におけるPGPB生存に影響を与える可能性があると仮定されている。これらの行動を研究するために、水耕植物成長アッセイは、植物の根の初期植民地化中および異なる成長への転移後の細菌の空間分布を定量化し、視覚化するためにアラビドプシスタリアナを使用して最適化されています。環境。このシステムの再現性と有用性は、よく研究されたPGPBシュードモナス・シミアで検証されます。複数の細菌種の存在が植物根の植民地化と維持のダイナミクスにどのように影響するかを調べるために、3つの細菌株(Arthrobacter、Curtobacterium、およびマイクロバクテリウム)からのモデルコミュニティ種)はもともとA.タリアナ根圏から単離され構築される。これらの多様な細菌種の存在は、シーケンシングベースの細菌コミュニティ研究に代わるものとなるこの水耕植物主化アッセイを用いて測定できることが示されている。このシステムを用いた今後の研究は、多種植物微生物叢の細菌行動の理解を時間の経過と共に、環境条件の変化に改善する可能性がある。
Introduction
細菌や真菌性疾患による作物の破壊は、食糧生産の低下を引き起こし、世界的な安定性を著しく破壊する可能性があります1.抑制土壌中の微生物が植物の健康を増大させる原因であるという発見に基づいて、科学者は、植物の微生物叢が特定の存在と豊富さを修正することによって植物の成長をサポートするために利用することができるかどうか尋ねました。細菌種3.植物の成長または発達を助けるために見出された細菌は、総称して植物成長促進細菌(PGPB)と呼ばれています。最近では、潜在的なPGPBを特定するだけの研究から、土壌、根の周り、根間(根表面を含む直接周囲および根表面を含む領域)における王国間相互作用がPGPBにどのように影響しているかを理解することにシフトしています。アクティビティ4.
PGPBによる根圏の植民地化は、未植民地化された植物に対する多様なストレスに応じて宿主植物の健康または発達を増加させることができる5.しかし、結果は、多くの場合、密接に制御された温室および実験室の設定6で観察されるものと比較して、ネイティブ土壌条件でより可変である。この違いの1つの仮説は、PGPBの増殖または挙動が、フィールド7、8における天然土壌細菌または真菌によって阻害されうるということです。根間細菌による有益な効果は、一般に、1)根に向かって移動する細菌の能力に依存し、2)バイオフィルム形成を通じて根を植民地化し、3)小分子の産生を介して宿主植物または病原体と相互作用する。代謝産物7,9.これらの植民地化行動のいずれも、隣接する微生物10の存在および活性の影響を受ける可能性がある。
我々は、根圏のこれらの異なる細菌の植民地化段階を定量化し、視覚化するシステムを設計した(図1)。このアプローチは、接種前の苗の植え付け中など、植物を新しい環境に移した後に、長期的なPGPB維持が観察されない理由を調査する研究を容易にする。アラビドプシスタリアナは、実験室研究における広範な使用だけでなく、その微生物相互作用に関する利用可能な十分なデータ11のために植物モデルとして選ばれました。システムには3つの段階があります:1)A.タリアナ増殖、2)細菌の植民地化、および3)細菌の維持(図1参照)。A.タリアナは陸上植物であるため、水耕系12において過度の水ストレスに苦しんでいないことを確認することが重要であった。Haney et al.13によって使用される方法に触発され、苗は液体成長媒体から芽を分離するためにプラスチックメッシュ上で成長する。このシステムは、植物宿主の健康と発達を損なっているようには見えず、液体11におけるA.タリアナの成長を改善する。植物の芽が表面の上に浮かぶと、根は液体細菌増殖培地に接種された細菌によって植民地化に完全にさらされる。これにより、成長に最も役立つ栄養素の植民地化を調べ、その後、植物がその成長をサポートするように設計された栄養培地で成長し続けられるように条件をシフトすることができます。両方の段階は、根13の無酸素症を防ぐために安定した揺れを含む。細菌は、コロニー化媒体または維持培地のいずれかからの転移後に植物根から可視化または定量することができる。この水耕栽培システムは非常に柔軟であり、研究者の興味に応じて実験条件や適用応力を容易に変更することができます。
この説明された方法は、植物微生物の相互作用に関するより大きな文献の文脈において重要である。異なる細菌。植物生物学研究室は、多くの場合、固体寒天に植物微生物の植民地化実験を行い、細菌の平面移動(もしそうなら)のみを可能にする一方で、その後の移植中に植物の潜在的に破壊的な操作を必要とします。対照的に、微生物学研究室は、頻繁に彼らの実験内の細菌の健康を優先し、植物14、15の不利益に。植物および微生物に焦点を当てたラボのこれらの異なる優先順位は、これらのグループ間の結果を比較することが歴史的に困難になってきた, それぞれが通常、関心のある彼らの生物を最適化するために実験条件を最適化するので15.ここで説明するフローティングメッシュ植物成長システムは、これまでの微生物学指向の研究に顕著な利点である完全な植物の浸漬を防ぎ、同時に、コロニー化を容易にするために細菌の成長と生存を一時的に最適化する。したがって、ここで提示するアッセイは、微生物学者の基準を満たしながら、植物生物学者(植物の過剰水和と触覚操作に関する)の両方の懸念に対処する可能性があります(異なる細菌の増殖条件と複数を可能にする)。種の相互作用)7.このプロトコルは、様々な細菌、植物、および環境条件での使用に適応できるように設計されています。
Protocol
Representative Results
Discussion
すべての環境の植物は、異なる細菌や真菌の数百万に数千人と相互作用5,7.これらの相互作用は、作物の収量と食糧生産に潜在的な影響を及ぼす植物の健康にマイナスと肯定的な影響を与えることができます。最近の研究はまた、PGPUによる作物の可変植民地化が、フィールドトライアル22における予測不可能な植物サイズと作物収?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、エネルギー生物環境研究省(DOE-BER 0000217519 to E.A.S.)、国立科学財団(INSPIRE IOS-1343020 to E.A.S.)が提供する研究資金によって支援されました。SLHはまた、国立科学財団大学院研究フェローシッププログラムによって支援されました。私たちは、細菌株と貴重な洞察力を提供するためにジェフリー・ダングル博士に感謝します。アンドリュー・クライン博士とマシュー・J・パワーズ博士に実験的な提案をいただいただいたことに感謝します。最後に、SLHは、特に創造的でアクセス可能な手段を通じて、科学を広めることが特権と責任であることを私たちに思い出させるためのソーシャルメディア上の接続に感謝したいと思います。
Materials
| Required Materials | |||
| 1.5 mL eppendorf tubes | any | N/A | |
| 24-well plates | BD Falcon | 1801343 | |
| Aeraseal | Excel Scientific | BE255A2 | |
| Autoclave | any | N/A | |
| Bacteria of Interest | any | N/A | Stored at -80˚C in 40% glycerol preferred |
| BactoAgar | BD | 2306428; REF 214010 | |
| bleach | any | N/A | |
| Conviron | any | N/A | Short Day Light-Dark Cycles: 460-600 µmoles/m²/s set at 9/15 hours light/dark at 18/21˚C, with inner power outlet |
| Dessicator Jar: glass or heavy plastic | any | N/A | |
| Ethanol | any | N/A | |
| Flame | any | N/A | |
| Forceps | any | N/A | |
| Incubator | any | N/A | At optimal temperature for growth of specified bacteria |
| Hydrochloric Acid | any | N/A | |
| Lennox LB Broth | RPI | L24066-1000.0 | |
| Microcentrifuge | any | N/A | |
| Micropipetters | any | N/A | Volumes 5 µL to 1000 µL |
| Microscope (preferably fluorescence) | any | N/A | Could be light if best definition not important |
| MS Salts + MES | RPI | M70300-50.0 | |
| Orbital Plate Shaker | any | N/A | Capable of running at 220 rpm for at least 96 hours |
| Petri Dishes | any | N/A | 50 mL total volume |
| Reservoirs | any | N/A | |
| Spectrophotometer | any | N/A | |
| Standard Hole Punch | any | N/A | Approximately 7mm punch diameter |
| Sterile water | any | N/A | |
| Surgical Tape | 3M | MMM1538-1 | |
| Teflon Mesh | McMaster-Carr | 1100t41 | |
| Ultrasonicator | any | N/A | |
| Vortex Mixer | any | N/A | |
| X-gal | GoldBio | x4281c | other vendors available |
| Suggested Materials | |||
| 24 Prong Ultrasonicator attachment | any | N/A | For sonicating multiple samples at once. Can be done individually |
| Alumaseal II | Excel Scientific | FE124F | |
| Glass beads | any | N/A | |
| Multipetter/Repetter | any | N/A | |
| Sterile 96-well plates | any | N/A | For serial dilutions. Can be replaced by eppendorf tubes |
| Biological Materials Used | |||
| Arabidopsis thaliana seeds | any | N/A | We recommend Arabidopsis Biological Resource Center for seed stocks |
| Arthrobacter nicotinovorans | Levy, et al. 2018 | ||
| Curtobacterium oceanosedimentum | Levy, et al. 2018 | ||
| Microbacterium oleivorans | Levy, et al. 2018 | ||
| Pseudomonas simiae WCS417r | Published in a similar system in Haney, et al. 2015. Strain used developed in Cole, et al. 2017 |
References
- Strange, R. N., Scott, P. R. Plant disease: a threat to global food security. Annual Review of Phytopathology. 43, 83-116 (2005).
- Cook, A. M., Grossenbacher, H., Hütter, R. Isolation and cultivation of microbes with biodegradative potential. Experientia. 39 (11), 1191-1198 (1983).
- Vacheron, J., et al. Plant growth-promoting rhizobacteria and root system functioning. Fronteirs in Plant Science. 4, 356 (2013).
- Backer, R., et al. Plant Growth-Promoting Rhizobacteria: Context, Mechanisms of Action, and Roadmap to Commercialization of Biostimulants for Sustainable Agriculture. Fronteirs in Plant Science. 9, 1473 (2018).
- Zamioudis, C., Pieterse, C. M. Modulation of host immunity by beneficial microbes. Molecular Plant-Microbe Interactions. 25 (2), 139-150 (2012).
- Kröber, M., et al. Effect of the strain Bacillus amyloliquefaciens FZB42 on the microbial community in the rhizosphere of lettuce under field conditions analyzed by whole metagenome sequencing. Frontiers in Microbiology. 5, 252 (2014).
- Bulgarelli, D., Schlaeppi, K., Spaepen, S., Ver Loren van Themaat, E., Schulze-Lefert, P. Structure and functions of the bacterial microbiota of plants. Annual Review of Plant Biology. 64, 807-838 (2013).
- Niu, B., Paulson, J. N., Zheng, X., Kolter, R. Simplified and representative bacterial community of maize roots. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (12), E2450-E2459 (2017).
- Richter-Heitmann, T., Eickhorst, T., Knauth, S., Friedrich, M. W., Schmidt, H. Evaluation of Strategies to Separate Root-Associated Microbial Communities: A Crucial Choice in Rhizobiome Research. Frontiers in Microbiology. 7, 773 (2016).
- Shank, E. A. Using coculture to detect chemically mediated interspecies interactions. Journal of Visual Experiments. (80), e50863 (2013).
- Woodward, A. W., Bartel, B. Biology in Bloom: A Primer on the Arabidopsis thaliana Model System. Genetics. 208 (4), 1337-1349 (2018).
- Alatorre-Cobos, F., et al. An improved, low-cost, hydroponic system for growing Arabidopsis and other plant species under aseptic conditions. BMC Plant Biology. 14, 69 (2014).
- Haney, C. H., Samuel, B. S., Bush, J., Ausubel, F. M. Associations with rhizosphere bacteria can confer an adaptive advantage to plants. Nature Plants. 1 (6), (2015).
- Massalha, H., Korenblum, E., Malitsky, S., Shapiro, O. H., Aharoni, A. Live imaging of root-bacteria interactions in a microfluidics setup. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (17), 4549-4554 (2017).
- Townsley, L., Yannarell, S. M., Huynh, T. N., Woodward, J. J., Shank, E. A. Cyclic di-AMP Acts as an Extracellular Signal That Impacts. MBio. 9 (2), (2018).
- Beauregard, P. B., Chai, Y., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. Bacillus subtilis biofilm induction by plant polysaccharides. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (17), E1621-E1630 (2013).
- Matthysse, A. G. Adherence of Bacteria to Plant Surfaces Measured in the Laboratory. Journal of Visual Experiments. 136 (136), (2018).
- Garcia-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry. Journal of Visual Experiments. (60), (2012).
- Cole, B. J., et al. Genome-wide identification of bacterial plant colonization genes. PLoS Biology. 15 (9), e2002860 (2017).
- Lundberg, D. S., et al. Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome. Nature. 488 (7409), 86-90 (2012).
- Grandchamp, G. M., Caro, L., Shank, E. A. Pirated Siderophores Promote Sporulation in Bacillus subtilis. Applied Environmental Microbiology. 83 (10), (2017).
- Gange, A. C., Gadhave, K. R. Plant growth-promoting rhizobacteria promote plant size inequality. Science Reports. 8 (1), 13828 (2018).
- Levy, A., et al. Genomic features of bacterial adaptation to plants. Nature Genetics. 50 (1), 138-150 (2018).
- Martínez-Hidalgo, P., Maymon, M., Pule-Meulenberg, F., Hirsch, A. M. Engineering root microbiomes for healthier crops and soils using beneficial, environmentally safe bacteria. Canada Journal of Microbiology. , 1-14 (2018).
- Niu, B., Kolter, R. Quantification of the Composition Dynamics of a Maize Root-associated Simplified Bacterial Community and Evaluation of Its Biological Control Effect. Bio Protocol. 8 (12), (2018).
