Här beskriver vi en hydroponiska växttillväxt analys för att kvantifiera Art närvaro och visualisera den rumsliga fördelningen av bakterier under initial kolonisering av växtrötter och efter deras överföring till olika tillväxt miljöer.
Bakterier bildar komplexa rhizosfären mikrobiomes formad av samverkande mikrober, större organismer, och den abiotiska miljön. Under laboratorieförhållanden, rhizosfären kolonisering av växttillväxt främjande bakterier (pgpb) kan öka hälsan eller utvecklingen av värdväxter i förhållande till okoloniserade växter. Men i Fältinställningar, bakteriella behandlingar med PGPB ger ofta inte betydande fördelar för grödor. En förklaring är att detta kan bero på förlust av PGPB under interaktioner med endogena jord mikrober över livslängden på växten. Denna möjlighet har varit svårt att bekräfta, eftersom de flesta studier fokuserar på den initiala koloniseringen snarare än underhåll av pgpb inom rhizosfären samhällen. Det är en hypotes här att församlingen, samexistens, och underhåll av bakteriesamhällen formas av deterministiska funktioner i rhizosfären microenvironment, och att dessa interaktioner kan påverka pgpb överlevnad i inhemska inställningar. För att studera dessa beteenden, en hydroponiska växt-Tillväxtanalys är optimerad med Arabidopsis thaliana att kvantifiera och visualisera den rumsliga fördelningen av bakterier under initial kolonisering av växtrötter och efter överföring till olika tillväxt Miljöer. Detta Systems reproducerbarhet och nytta är sedan valideras med den väl studerade PGPB Pseudomonas simiae. För att undersöka hur närvaron av flera bakteriearter kan påverka kolonisering och underhåll dynamik på växten roten, en modell gemenskap från tre bakteriestammar (en Arthrobacter, Curtobacterium, och microbacterium arter) som ursprungligen isolerats från A. thaliana rhizosfären är konstruerad. Det visas att närvaron av dessa olika bakteriearter kan mätas med hjälp av denna hydroponiska Plant-maintanence assay, som ger ett alternativ till sekvenserings-baserade bakteriella samhällsstudier. Framtida studier med detta system kan förbättra förståelsen av bakterie beteende i flerartsbaserade växt mikrobiomer över tid och i förändrade miljöförhållanden.
Gröda förstörelse av bakterie-och svampsjukdomar resulterar i sänkt livsmedelsproduktion och kan allvarligt störa den globala stabiliteten1. Baserat på upptäckten att mikrober i suppressiva jordar är ansvariga för att öka växthälsan2, forskare har frågat om växten mikrobiomet kan utnyttjas för att stödja växternas tillväxt genom att ändra förekomst och överflöd av särskilda bakteriearter3. Bakterier som finns till stöd i växternas tillväxt eller utveckling benämns kollektivt växttillväxt främjande bakterier (PGPB). På senare tid har studier skiftat från att bara identifiera potentiella pgpb att förstå hur interkingdom interaktioner i jorden, runt rötter, eller i rhizosfären (området direkt omgivande och inklusive roten ytan) kan påverka pgpb verksamhet4.
Rhizosphere kolonisering av PGPB kan öka hälsan eller utvecklingen av värdväxter som svar på olika stressorer i förhållande till okoloniserade växter5. Emellertid, resultaten är ofta mer varierande i inhemska markförhållanden jämfört med de som observerats i den nära kontrollerade växthus-och laboratorie inställningar6. En hypotes för denna skillnad är att tillväxten eller beteendet hos pgpb kan hämmas av infödda jordbakterier eller svampar i fälten7,8. Gynnsamma effekter av rhizosfären bakterier beror i allmänhet på förmågan hos bakterierna att 1) lokalisera och gå mot roten, 2) kolonisera roten genom biofilm formation, och 3) interagera med värd växten eller patogener via produktion av små molekyl metaboliter7,9. Någon av dessa kolonisering beteenden kan påverkas av närvaron och aktiviteten av angränsande mikrober10.
Vi designade ett system för att kvantifiera och visualisera dessa distinkta bakteriella koloniseringsstadier av rhizosfären (figur 1). Detta tillvägagångssätt kommer att underlätta studier som undersöker varför långsiktigt PGPB underhåll ibland inte observeras efter överföring av växter till nya miljöer, såsom vid plantering av pre-inokulerade plantor. Arabidopsis thaliana som valdes som en växt modell på grund av dess omfattande användning i laboratoriestudier samt de rikliga data som finns om dess mikrobiella interaktioner11. Det finns tre stadier i systemet: 1) A. thaliana Growth, 2) bakteriell kolonisering, och 3) bakterie underhåll (se figur 1). Eftersom a. thaliana är en markbunden anläggning, var det viktigt att se till att det inte var lidande onödig vattenstress i hydroponiska systemet12. Inspirerad av de metoder som används av Haney et al.13, plantorna odlas på plast mesh för att separera skott från flytande odlingssubstrat. Detta system verkar inte äventyra hälsan och utvecklingen av anläggningen värd, och det förbättrar en. thaliana tillväxt i flytande11. När anläggningen skjuter flyter över ytan, rötterna är fullt utsatta för kolonisering av bakterier inokuleras i flytande bakterietillväxt medium. Detta tillåter bakterier av intresse som skall undersökas för kolonisering i näringsämnen som är mest gynnsam för tillväxt, medan sedan skiftande förhållanden för att tillåta växten att fortsätta växa i ett näringsämne medium som utformats för att stödja dess tillväxt. Båda stegen inkluderar stadig skakning för att förhindra anoxia av roten13. Bakterier kan visualiseras eller kvantifieras från växternas rötter efter överföring från antingen koloniseringsmediet eller underhålls mediet. Detta hydroponiska systemet är mycket flexibelt, vilket gör att experimentella förhållanden och tillämpade spänningar lätt kan ändras beroende på intressen av forskarna.
Denna beskrivna metod är viktig i samband med den större kroppen av litteratur om växt-Microbe interaktioner eftersom det ger ett robust system för att studera dessa interaktioner på roten ytan samtidigt som den är anpassningsbar till tillväxt preferenser olika bakterier. Växtbiologi Labs utför ofta växt-Microbe kolonisering experiment på fast agar, vilket möjliggör endast planar rörelse (om det) av bakterier samtidigt som kräver potentiellt destruktiva manipulation av växter under efterföljande överföring. I kontrast, mikrobiologi Labs har ofta prioriterat hälsan hos bakterierna i sina experiment, till nackdel för växterna14,15. Dessa olika prioriteringar av växt-och mikrobiologi fokuserade laboratorier har historiskt gjort det svårt att jämföra resultat mellan dessa grupper, eftersom varje typiskt optimerar experimentella förhållanden för att optimera deras organism av intresse15. Den flytande-mesh-växt-tillväxtsystem som beskrivs här förhindrar full Plant nedsänkning, en anmärkningsvärd fördel för tidigare mikrobiologi orienterade studier, samtidigt också tillfälligt optimera tillväxten och överlevnaden av bakterier för att underlätta kolonisering. Sålunda, det test som vi presenterar här kan ta upp farhågor från både växt biologer (om över-hydrering och taktil manipulation av anläggningen) samtidigt som uppfyller kriterierna för mikrobiologer (möjliggör olika bakterietillväxt villkor och flera Artens interaktioner)7. Detta protokoll är utformat för att vara anpassningsbar för användning med olika bakterier, växter och miljöförhållanden.
Växter i alla miljöer samverkar med tusentals till miljontals olika bakterier och svampar5,7. Dessa interaktioner kan antingen negativt och positivt påverka växthälsan, med potentiella effekter på skördeavkastning och livsmedelsproduktion. Nyligen arbete tyder också på att varierande kolonisering av grödor av PGPBs kan redogöra för oförutsägbar växt storlek och skördeavkastning i fältförsök22. Förstå mekanismerna bakom…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av forskningsmedel från Institutionen för energi biologisk och miljö forskning (DOE-BER 0000217519 till E.A.S.), National Science Foundation (INSPIRE IOS-1343020 till E. A. S). SLH stöddes också av National Science Foundation Graduate Research Fellowship program. Vi tackar Dr Jeffery Dangl för att ge bakteriestammar och ovärderlig insikt. Vi tackar Dr Andrew Klein och Matthew J. Powers för experimentella förslag. Slutligen vill SLH tacka anslutningar på sociala medier för att påminna oss om att spridning av vetenskap är ett privilegium och ett ansvar, särskilt genom kreativa och tillgängliga medel.
Required Materials | |||
1.5 mL eppendorf tubes | any | N/A | |
24-well plates | BD Falcon | 1801343 | |
Aeraseal | Excel Scientific | BE255A2 | |
Autoclave | any | N/A | |
Bacteria of Interest | any | N/A | Stored at -80˚C in 40% glycerol preferred |
BactoAgar | BD | 2306428; REF 214010 | |
bleach | any | N/A | |
Conviron | any | N/A | Short Day Light-Dark Cycles: 460-600 µmoles/m²/s set at 9/15 hours light/dark at 18/21˚C, with inner power outlet |
Dessicator Jar: glass or heavy plastic | any | N/A | |
Ethanol | any | N/A | |
Flame | any | N/A | |
Forceps | any | N/A | |
Incubator | any | N/A | At optimal temperature for growth of specified bacteria |
Hydrochloric Acid | any | N/A | |
Lennox LB Broth | RPI | L24066-1000.0 | |
Microcentrifuge | any | N/A | |
Micropipetters | any | N/A | Volumes 5 µL to 1000 µL |
Microscope (preferably fluorescence) | any | N/A | Could be light if best definition not important |
MS Salts + MES | RPI | M70300-50.0 | |
Orbital Plate Shaker | any | N/A | Capable of running at 220 rpm for at least 96 hours |
Petri Dishes | any | N/A | 50 mL total volume |
Reservoirs | any | N/A | |
Spectrophotometer | any | N/A | |
Standard Hole Punch | any | N/A | Approximately 7mm punch diameter |
Sterile water | any | N/A | |
Surgical Tape | 3M | MMM1538-1 | |
Teflon Mesh | McMaster-Carr | 1100t41 | |
Ultrasonicator | any | N/A | |
Vortex Mixer | any | N/A | |
X-gal | GoldBio | x4281c | other vendors available |
Suggested Materials | |||
24 Prong Ultrasonicator attachment | any | N/A | For sonicating multiple samples at once. Can be done individually |
Alumaseal II | Excel Scientific | FE124F | |
Glass beads | any | N/A | |
Multipetter/Repetter | any | N/A | |
Sterile 96-well plates | any | N/A | For serial dilutions. Can be replaced by eppendorf tubes |
Biological Materials Used | |||
Arabidopsis thaliana seeds | any | N/A | We recommend Arabidopsis Biological Resource Center for seed stocks |
Arthrobacter nicotinovorans | Levy, et al. 2018 | ||
Curtobacterium oceanosedimentum | Levy, et al. 2018 | ||
Microbacterium oleivorans | Levy, et al. 2018 | ||
Pseudomonas simiae WCS417r | Published in a similar system in Haney, et al. 2015. Strain used developed in Cole, et al. 2017 |