Yüzen hidroponik sistemde Arabidopsis thaliana kökleri üzerinde bakteriyel kolonizasyon ve bakım izleme
Summary
Burada bir hidroponik bitki büyüme tahlil türler varlığı ölçmek ve bitki kökleri ilk kolonizasyon ve farklı büyüme ortamları içine transfer edildikten sonra bakterilerin uzamsal dağılımı görselleştirmek için açıklanmaktadır.
Abstract
Bakteriler, etkileşen mikroplar, daha büyük organizmalar ve Abiotik çevre ile şekillendirilen kompleks rizosfer ‘de microbiomes oluşturur. Laboratuvar koşullarında, bitki büyüme teşvik bakteri (pgpb) tarafından rizosfer ‘de kolonizasyon sağlığını veya kolonize bitkiler göreli ev sahibi bitkilerin gelişimini artırabilir. Ancak, alan ayarlarında, PGPB ile bakteriyel tedaviler genellikle bitkileri için önemli faydalar sağlamaz. Bir açıklama bu bitki ömrü boyunca endojen toprak mikroplar ile etkileşimler sırasında PGPB kaybı nedeniyle olabilir olmasıdır. Bu olasılık, çoğu çalışmada rizosfer ‘de topluluklar içinde pgpb bakım yerine ilk kolonizasyon odaklanmak beri, onaylamak zor olmuştur. Burada hipotez, montaj, birlikte olma ve bakteriyel toplulukların Bakımı rizosfer ‘de mikroortamın deterministic özellikleri ile şekillendirilir ve bu etkileşimlerin yerel ayarlarında pgpb hayatta kalma etkileyebilir. Bu davranışları incelemek için, bir hidroponik bitki büyüme tahlil ölçmek ve bitki kökleri ilk kolonizasyon sırasında bakterilerin uzamsal dağılımı görselleştirmek ve farklı büyüme transfer sonra Arabidopsis thaliana kullanılarak optimize edilmiştir Ortam. Bu sistemin yeniden üretilebilirliği ve yarar daha sonra iyi okudu PGPB Pseudomonas simiaeile doğrulanır. Birden fazla bakteriyel türün varlığının bitki kökü üzerinde kolonizasyon ve bakım dinamiklerini nasıl etkileyebileceğini araştırmak için, üç bakteriyel sudan bir model topluluğu (bir Arthrobacter, Curtobacteriumve microbacterium türleri) aslen A. thaliana rizosfer ‘de ‘den izole edilmiştir. Bu farklı bakteriyel türlerin varlığı bu Hidroponik bitki-bakım tahlil kullanılarak ölçülebilir gösterilmiştir, hangi sıralama tabanlı bakteriyel toplum çalışmaları için bir alternatif sağlar. Bu sistemi kullanarak gelecekteki çalışmalar multispecies bitki mikrobiomes zaman içinde ve değişen çevresel koşullarda bakteriyel davranışlar anlayışını artırabilir.
Introduction
Bakteriyel ve mantar hastalıklarla mahsul imha azaltılan gıda üretimi ile sonuçlanır ve ciddi küresel istikrar bozabilir1. Bastırıcı topraklarda mikropların bitki sağlığı artırmak için sorumlu olduğunu keşif dayanarak2, bilim adamları bitki mikrobiome varlığı ve belirli bolluğu değiştirerek bitki büyümesini desteklemek için yararlanarak olup olmadığını sordu bakteriyel türler3. Bitki büyüme veya gelişim yardım bulundu bakteri topluca bitki büyüme teşvik bakteri (PGPB) olarak adlandırılır. Daha yakın zamanda, çalışmalar sadece potansiyel pgpb tanımlamak için nasıl toprak, kökleri etrafında veya rizosfer ‘de (bölge doğrudan çevreleyen ve kök yüzeyi dahil) pgpb etkileyebilir nasıl interkingdom etkileşimleri anlamak için kaymıştır Etkinlik4.
PGPB tarafından Rhizosphere kolonizasyonu, kolonize edilmemiş tesislere göre çeşitli streslere yanıt olarak ev sahibi tesislerin sağlığını veya gelişimini artırabilir5. Ancak, sonuçlar sıklıkla doğal toprak koşullarında yakından kontrollü sera ve laboratuar ayarlarında gözlenen göre daha değişkendir6. Bu fark için bir hipotez, pgpb ‘nin büyüme veya davranışının7,8‘ deki yerli toprak bakterileri veya mantarları tarafından önlenmesi olabilir. Rizosfer ‘de bakterilerin yararlı etkileri genellikle 1 bakteri yeteneğine bağlıdır) bulmak ve köküne doğru hareket, 2) biyofilm oluşumu ile kök kolonize, ve 3) küçük molekül üretimi ile ev sahibi bitki veya patojenler ile etkileşim metabolitler7,9. Bu kolonizasyon davranışları herhangi komşu mikropların varlığı ve aktivite etkilenebilir10.
Rizosfer ‘de ‘in bu farklı bakteriyel kolonizasyon aşamalarını ölçmek ve görselleştirecek bir sistem tasarladık (Şekil 1). Bu yaklaşım, uzun vadeli PGPB bakımının bazen bitkilerin önceden inoculated Fide dikimi sırasında olduğu gibi yeni ortamlar içine aktarılması sonrasında nasıl gözlemlendiği konusunda araştırmalar yapmayı kolaylaştıracaktır. Arabidopsis thaliana olarak laboratuvar çalışmalarında geniş kullanımı yanı sıra mikrobiyal etkileşimleri hakkında mevcut geniş veri nedeniyle bir bitki modeli olarak seçildi11. Sistemde üç aşama vardır: 1) A. thaliana büyüme, 2) bakteriyel kolonizasyon, ve 3) bakteriyel bakım (bkz. Şekil 1). Çünkü a. thaliana bir karasal bitki, bu Hydroponic sistemi12içinde gereksiz su stres acı olmadığını sağlamak için önemliydi. Haney ve el.13tarafından kullanılan yöntemlerden esinlenerek, fide sıvı büyüme ortamından çekimi ayırmak için plastik mesh üzerinde yetiştirilen. Bu sistem sağlık ve bitki Konağı gelişimi tehlikeye görünmüyor ve sıvı11 bir. thaliana büyüme geliştirir. Bitki çekimi yüzeyin üzerinde yüzen gibi, kökleri tamamen sıvı bakteriyel büyüme ortamına aşı bakteriler tarafından kolonizasyon maruz kalır. Bu ilgi bakteriler en büyüme için elverişli besin kolonizasyon için incelenmesini sağlar, daha sonra bitki büyüme desteklemek için tasarlanmış bir besin ortamında büyüyen devam etmek için koşullar değişen süre. Her iki aşamada da kök13kanda oksijen azlığı önlemek için sabit sallayarak içerir. Bakteriler, kolonizasyon ortamından veya bakım ortamına transfer edildikten sonra bitki köklerinden görüntülenebilir veya niceleyilebilir. Bu hidroponik sistem çok esnektir, deneysel koşullara izin verir ve uygulamalı stresler araştırmacılar ilgi alanlarına bağlı olarak kolayca değiştirilecektir.
Bu tanımlanan yöntem, bitki-mikrobe etkileşimleri hakkında literatürde daha büyük gövde bağlamında önemlidir, çünkü kök yüzeyinde bu etkileşimlerin incelenmesi için sağlam bir sistem sağlar, çünkü aynı zamanda büyüme tercihlerine göre özelleştirilebilir farklı bakteriler. Bitki biyoloji laboratuvarları genellikle katı agar bitki mikrobe kolonizasyon denemeleri gerçekleştirmek, sadece düzlemsel hareket için izin (Eğer bu) bakteri de sonraki transfer sırasında bitkilerin potansiyel olarak yıkıcı manipülasyon gerektirirken. Buna karşılık, Mikrobiyoloji laboratuvarları genellikle onların deneyler içinde bakterilerin sağlığını önceliklenmiş, bitkilerin zarar için14,15. Bitki ve Mikrobiyoloji odaklı laboratuvarlar bu farklı öncelikleri tarihsel zor bu gruplar arasında sonuçları karşılaştırmak için yapılmış, çünkü her genellikle ilgi organizmalarını optimize etmek için deneysel koşulları optimize15. Burada açıklanan yüzen Mesh-bitki-büyüme sistemi tam bitki dalgıç, önceki Mikrobiyoloji odaklı çalışmalar için önemli bir avantaj önler, aynı zamanda geçici kolonizasyon kolaylaştırmak için bakteri büyüme ve hayatta kalma optimize ederken. Böylece, biz burada mevcut tahlil her iki bitki biyologlar (aşırı hidrasyon ve bitki dokunsal manipülasyon hakkında) mikrobiyologlar kriterleri tatmin ederken (farklı bakteriyel büyüme koşulları ve birden fazla izin kaygıları adres olabilir tür etkileşimleri)7. Bu protokol çeşitli bakteriler, bitkiler ve çevresel koşullar ile kullanılmak üzere uyarlanabilir şekilde tasarlanmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tüm ortamlarda bitkiler milyonlarca farklı bakteri ve mantar5,7ile etkileşim. Bu etkileşimler, bitki sağlığını olumsuz ve olumlu yönde etkileyebilir, ürün verimi ve gıda üretiminde potansiyel etkilere neden olabilir. Son çalışmalar ayrıca PGPBs tarafından bitkileri değişken kolonizasyon öngörülemeyen bitki boyutu ve alan denemeleri22ürün verimi için hesap olabileceğini göstermektedir. Bu etkileşimlerin arkası…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, enerji biyolojik ve çevresel araştırmalar bölümü (DOE-BER 0000217519 için E.A.S.), Ulusal Bilim Vakfı (E. A. S için IOS-1343020 Ilham) tarafından sağlanan araştırma fonları tarafından destekleniyordu. SLH Ayrıca Ulusal Bilim Vakfı lisansüstü araştırma bursu programı tarafından destekleniyordu. Dr. Jeffery Dangl ‘a, bakteriyel suşlar ve paha biçilmez bir anlayış sağlamak için teşekkür ederiz. Biz deneysel öneriler için Dr Andrew Klein ve Matthew J. Powers teşekkür ederiz. Son olarak, SLH bize bilim yaymak bir ayrıcalık ve bir sorumluluk, özellikle yaratıcı ve erişilebilir yollarla olduğunu hatırlatan için sosyal medya bağlantıları teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Required Materials | |||
| 1.5 mL eppendorf tubes | any | N/A | |
| 24-well plates | BD Falcon | 1801343 | |
| Aeraseal | Excel Scientific | BE255A2 | |
| Autoclave | any | N/A | |
| Bacteria of Interest | any | N/A | Stored at -80˚C in 40% glycerol preferred |
| BactoAgar | BD | 2306428; REF 214010 | |
| bleach | any | N/A | |
| Conviron | any | N/A | Short Day Light-Dark Cycles: 460-600 µmoles/m²/s set at 9/15 hours light/dark at 18/21˚C, with inner power outlet |
| Dessicator Jar: glass or heavy plastic | any | N/A | |
| Ethanol | any | N/A | |
| Flame | any | N/A | |
| Forceps | any | N/A | |
| Incubator | any | N/A | At optimal temperature for growth of specified bacteria |
| Hydrochloric Acid | any | N/A | |
| Lennox LB Broth | RPI | L24066-1000.0 | |
| Microcentrifuge | any | N/A | |
| Micropipetters | any | N/A | Volumes 5 µL to 1000 µL |
| Microscope (preferably fluorescence) | any | N/A | Could be light if best definition not important |
| MS Salts + MES | RPI | M70300-50.0 | |
| Orbital Plate Shaker | any | N/A | Capable of running at 220 rpm for at least 96 hours |
| Petri Dishes | any | N/A | 50 mL total volume |
| Reservoirs | any | N/A | |
| Spectrophotometer | any | N/A | |
| Standard Hole Punch | any | N/A | Approximately 7mm punch diameter |
| Sterile water | any | N/A | |
| Surgical Tape | 3M | MMM1538-1 | |
| Teflon Mesh | McMaster-Carr | 1100t41 | |
| Ultrasonicator | any | N/A | |
| Vortex Mixer | any | N/A | |
| X-gal | GoldBio | x4281c | other vendors available |
| Suggested Materials | |||
| 24 Prong Ultrasonicator attachment | any | N/A | For sonicating multiple samples at once. Can be done individually |
| Alumaseal II | Excel Scientific | FE124F | |
| Glass beads | any | N/A | |
| Multipetter/Repetter | any | N/A | |
| Sterile 96-well plates | any | N/A | For serial dilutions. Can be replaced by eppendorf tubes |
| Biological Materials Used | |||
| Arabidopsis thaliana seeds | any | N/A | We recommend Arabidopsis Biological Resource Center for seed stocks |
| Arthrobacter nicotinovorans | Levy, et al. 2018 | ||
| Curtobacterium oceanosedimentum | Levy, et al. 2018 | ||
| Microbacterium oleivorans | Levy, et al. 2018 | ||
| Pseudomonas simiae WCS417r | Published in a similar system in Haney, et al. 2015. Strain used developed in Cole, et al. 2017 |
References
- Strange, R. N., Scott, P. R. Plant disease: a threat to global food security. Annual Review of Phytopathology. 43, 83-116 (2005).
- Cook, A. M., Grossenbacher, H., Hütter, R. Isolation and cultivation of microbes with biodegradative potential. Experientia. 39 (11), 1191-1198 (1983).
- Vacheron, J., et al. Plant growth-promoting rhizobacteria and root system functioning. Fronteirs in Plant Science. 4, 356 (2013).
- Backer, R., et al. Plant Growth-Promoting Rhizobacteria: Context, Mechanisms of Action, and Roadmap to Commercialization of Biostimulants for Sustainable Agriculture. Fronteirs in Plant Science. 9, 1473 (2018).
- Zamioudis, C., Pieterse, C. M. Modulation of host immunity by beneficial microbes. Molecular Plant-Microbe Interactions. 25 (2), 139-150 (2012).
- Kröber, M., et al. Effect of the strain Bacillus amyloliquefaciens FZB42 on the microbial community in the rhizosphere of lettuce under field conditions analyzed by whole metagenome sequencing. Frontiers in Microbiology. 5, 252 (2014).
- Bulgarelli, D., Schlaeppi, K., Spaepen, S., Ver Loren van Themaat, E., Schulze-Lefert, P. Structure and functions of the bacterial microbiota of plants. Annual Review of Plant Biology. 64, 807-838 (2013).
- Niu, B., Paulson, J. N., Zheng, X., Kolter, R. Simplified and representative bacterial community of maize roots. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (12), E2450-E2459 (2017).
- Richter-Heitmann, T., Eickhorst, T., Knauth, S., Friedrich, M. W., Schmidt, H. Evaluation of Strategies to Separate Root-Associated Microbial Communities: A Crucial Choice in Rhizobiome Research. Frontiers in Microbiology. 7, 773 (2016).
- Shank, E. A. Using coculture to detect chemically mediated interspecies interactions. Journal of Visual Experiments. (80), e50863 (2013).
- Woodward, A. W., Bartel, B. Biology in Bloom: A Primer on the Arabidopsis thaliana Model System. Genetics. 208 (4), 1337-1349 (2018).
- Alatorre-Cobos, F., et al. An improved, low-cost, hydroponic system for growing Arabidopsis and other plant species under aseptic conditions. BMC Plant Biology. 14, 69 (2014).
- Haney, C. H., Samuel, B. S., Bush, J., Ausubel, F. M. Associations with rhizosphere bacteria can confer an adaptive advantage to plants. Nature Plants. 1 (6), (2015).
- Massalha, H., Korenblum, E., Malitsky, S., Shapiro, O. H., Aharoni, A. Live imaging of root-bacteria interactions in a microfluidics setup. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (17), 4549-4554 (2017).
- Townsley, L., Yannarell, S. M., Huynh, T. N., Woodward, J. J., Shank, E. A. Cyclic di-AMP Acts as an Extracellular Signal That Impacts. MBio. 9 (2), (2018).
- Beauregard, P. B., Chai, Y., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. Bacillus subtilis biofilm induction by plant polysaccharides. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (17), E1621-E1630 (2013).
- Matthysse, A. G. Adherence of Bacteria to Plant Surfaces Measured in the Laboratory. Journal of Visual Experiments. 136 (136), (2018).
- Garcia-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry. Journal of Visual Experiments. (60), (2012).
- Cole, B. J., et al. Genome-wide identification of bacterial plant colonization genes. PLoS Biology. 15 (9), e2002860 (2017).
- Lundberg, D. S., et al. Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome. Nature. 488 (7409), 86-90 (2012).
- Grandchamp, G. M., Caro, L., Shank, E. A. Pirated Siderophores Promote Sporulation in Bacillus subtilis. Applied Environmental Microbiology. 83 (10), (2017).
- Gange, A. C., Gadhave, K. R. Plant growth-promoting rhizobacteria promote plant size inequality. Science Reports. 8 (1), 13828 (2018).
- Levy, A., et al. Genomic features of bacterial adaptation to plants. Nature Genetics. 50 (1), 138-150 (2018).
- Martínez-Hidalgo, P., Maymon, M., Pule-Meulenberg, F., Hirsch, A. M. Engineering root microbiomes for healthier crops and soils using beneficial, environmentally safe bacteria. Canada Journal of Microbiology. , 1-14 (2018).
- Niu, B., Kolter, R. Quantification of the Composition Dynamics of a Maize Root-associated Simplified Bacterial Community and Evaluation of Its Biological Control Effect. Bio Protocol. 8 (12), (2018).
