Summary

القياس الكمي لتكاثر CD4 - T الخاصة بمستضد الإنسانباستخدام Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Published: June 04, 2019
doi:

Summary

يعرض هنا بروتوكول لقياس تكاثر خلايا CD4+ T استجابة للبروتينات المضادة للجينات أو الببتيدات باستخدام تخفيف الصبغة. هذا الفحص حساس بشكل خاص للخلايا T النادرة الخاصة بالمستضد ويمكن تعديله لتسهيل استنساخ الخلايا الخاصة بالمستضد.

Abstract

وصف هو بسيط، في المختبر، طريقة تعتمد على تخفيف الصبغة لقياس انتشار الخلايا CD4+ T الخاصة بالمستضد في الخلايا أحادية النووية للدم المحيطي البشري (PBMCs). تطوير مستقرة، غير سامة، والأصباغ الفلورية مثل carboxyfluorescein succinimidyl استر (CFSE) يسمح للخلايا T نادرة، مستضد محددة أن تكون متميزة عن المارة عن طريق التضاؤل في تلطيخ الفلورسنت، كما تم الكشف عن طريق قياس التدفق الخلوي. ولهذه الطريقة المزايا التالية على النُهج البديلة: ‘1’ أنها حساسة جداً للخلايا T ذات التردد المنخفض، ‘2’ لا حاجة إلى معرفة المستضد أو الظهارة، ‘3’ يمكن تحليل النمط الظاهري للخلايا المستجيبة، و’4′ قابلة للتطبيق، وتستجيب يمكن فرز الخلايا واستخدامها لمزيد من التحليل، مثل استنساخ الخلايا T.

Introduction

القدرة على الكشف عن ودراسة الخلايا T مستضد محددة مهم في دراسات الحصانة الخلية بوساطة. ومع ذلك، فإن القيام بذلك يشكل تحدياً كبيراً لاستجابات CD4+ الخلايا T الخاصة بمستضد تلقائي، والتي هي ضعيفة جداً ويصعب الكشف عنها. وهناك طريقة شائعة تستخدم للكشف عن انتشار الخلايا الليمفاوية مستضد محدد هو [3H]-thymidine، وهو النيوكليوتيد المسمى لاسلكيا المدرجة في الحمض النووي للخلايا المتكاثرة. على الرغم من أن اختبار [3H]-thymidine يمكن الكشف عن تخليق الحمض النووي، وهذا الأسلوب هو مقياس غير مباشر لتقسيم الخلايا، لأن تخليق الحمض النووي يمكن أن تبدأ بشكل مستقل عن الانقسام الانقسام (أي، أثناء ازدواجية الجينات والمبرمج1). وتتفاقم هذه المسألة من حقيقة أن انتشار الخلايا الخاصة بالمستضد يمكن أن يؤدي إلى وجود المبرمج ينوب شناطكبير ،مما يؤدي إلى احتمال المبالغة في تقدير الانتشار الخاص بالمستضد. وعلاوة على ذلك، فإن طريقة [3H]-thymidine لا توفر معلومات فينوتيبيك لتكاثر الخلايا الليمفاوية، مثل CD4+ أو CD8+ انتشار النسب في PBMCs حفز مع الببتيدات المضادة للجينات.

الببتيد-MHC تترامر تلطيخ هو وسيلة تستخدم على نطاق واسع للكشف عن واستنساخ CD8 المضادة محددة+ خلايا T. هذا هو أسلوب راسخة7،8،9،10؛ ومع ذلك، يتطلب الاستنساخ القائم على رباعي اتترار معرفة موجودة بتقييد الظهارة/MHC، ويتطلب كل epitope رباعي11الخاص به ، مما يحد من نطاق اكتشاف واستنساخ الخلايا T الجديدة الخاصة بالظعوت. يمكن استخدام الانتشار القائم على CFSE مع الببتيدات أو البروتينات أو الليسات الخلوية. البروتوكول الموضح هنا بسيط وقوي على حد سواء، ويمكن فرز الخلايا CD4+ T المستجيبة للاستخدام في المصب الاختبارات التوصيف الوظيفي والكيميائية الحيوية12،13.

Protocol

وأعطى جميع الأشخاص موافقة مستنيرة قبل جمع الدم المحيطي. وقد منحت شركة سانت فنسنت هوسبيتال (HREC-A 135/08، وHREC-A 161/15) الموافقة الأخلاقية على التجارب التي تستخدم PBMC. 1. إعداد الكاشف وسائل الإعلام خلية T الإنسان إعداد وسائل الإعلام RP-5 لزراعة PBMC، والذي يتكون من RPMI 164…

Representative Results

التحفيز في المختبر من PBMCs البشرية مع بروتين توكسويد التيتانوس: كانت ملطخة PBMCs مع CFSE وحفز لمدة 7 أيام في وجود توكسويد التيتانوس. وأظهرت جميع الجهات المانحة تقريبا استجابة قوية من الخلايا T إلى توكسويد التيتانوس لأنها قد تم تطعيمها، مما يجعل توكسويد التيتانوس مستضد اقويد إي?…

Discussion

الانتشار القائم على CFSE هو طريقة بسيطة وقوية للكشف عن وتعداد خلايا CD4+ T البشرية الخاصة بالمستضد. وقد ثبت سابقا أن استخدام التركيز الأمثل من CFSE أمر ضروري للحصول على أفضل النتائج4. فهناك الكثير من الـ CFSE يلغي الانتشار، في حين أن القليل جدا لا يسمح بتمييز الخلايا المقسمة وغير…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وقد تم دعم هذا العمل من قبل: مؤسسة أبحاث مرض السكري للأحداث (JDRF 5-CDA-2014-210-A-N] (S.M.). المجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية (NHMRC GNT123586) (S. M.)، جائزة أبحاث السكري الأسترالية الاستئمانية للألفية (Y17M1-MANS) (S.M.)، برنامج دعم البنية التحتية التشغيلية للحكومة الفيكتورية (S.M., A.D., E. T., M.S.), وNHMRC منحة الدراسات العليا APP1094337 وJDRF منحة الدكتوراه في المتابعة (M.S.).

Materials

Anti-human CD4-AlexaFluor647 Biolegend 317422 RRID:AB_2716180
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) ThermoFisher C1157
Ficoll-Paque Plus GE Healthcare 71-7167-00
Glutamax (1x) Gibco 35050
Influenza A H1N1 (PR8) Matrix protein 1 Sino Biological 40010-V07E
Non-Essential amino acids (1x) Gibco 11140
Penicillin/ Streptomycin (1x) Gibco 15070063
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich D8537
Pooled human serum Australian Red Cross N/A
Proinsulin C-peptide PI33-63 Purar Chemicals N/A Custom made synthetic peptide
RPMI 1640 Sigma-Aldrich R8758
Tetanus Toxoid protein Statens Serum Intitut N/A

References

  1. Duque, A., Rakic, P. Different effects of BrdU and 3H-Thymidine incorporation into DNA on cell proliferation, position and fate. Journal of Neuroscience. 31, 15205-15217 (2011).
  2. Mannering, S. I., Zhong, J. I. E., Cheers, C. T-cell activation, proliferation and apoptosis in primary Listeria monocytogenes infection. Immunology. 106, 87-95 (2002).
  3. Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 171, 131-137 (1994).
  4. Mannering, S. I., et al. A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells. Journal of Immunological Methods. 283, 173-183 (2003).
  5. Quah, B. J. C., Parish, C. R. The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation. Journal of Visualized Experiments. , 4-7 (2010).
  6. Ten Brinke, A., et al. Monitoring T-cell responses in translational studies: Optimization of dye-based proliferation assay for evaluation of antigen-specific responses. Frontiers in Immunology. 8, 1-15 (2017).
  7. Gillespie, G. M. A., et al. Strong TCR Conservation and Altered T Cell Cross-Reactivity Characterize a B*57-Restricted Immune Response in HIV-1 Infection. Journal of Immunolgy. 177, 3893-3902 (2006).
  8. Tynan, F. E., et al. High Resolution Structures of Highly Bulged Viral Epitopes Bound to Major Histocompatibility Complex Class I: Implications for t-cell receptor engagement and t-cell immunodominance. Journal of Biological Chemistry. 280, 23900-23909 (2005).
  9. Blanchard, N., et al. Endoplasmic reticulum aminopeptidase associated with antigen processing defines the composition and structure of MHC class I peptide repertoire in normal and virus-infected cells. Journal of Immunology. 184, 3033-3042 (2010).
  10. Glanville, J., et al. Identifying specificity groups in the T cell receptor repertoire repertoire. Nature. 547, 94-98 (2017).
  11. Wooldridge, L., et al. Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide MHC. Immunology. 126, 147-164 (2009).
  12. Mannering, S. I., et al. An efficient method for cloning human autoantigen-specific T cells. Journal of Immunological Methods. 298, 83-92 (2005).
  13. So, M., et al. Proinsulin C-peptide is an autoantigen in people with type 1 diabetes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (2018).
  14. Hui-Yuen, J., Mcallister, S., Koganti, S., Hill, E., Bhaduri-Mcintosh, S. Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines. Journal of Visualized Experiments. , 2-7 (2011).
  15. Alexander-Miller, M. A., Leggatt, G. R., Berzofsky, J. A., Moss, B. Selective expansion of high or low avidity cytotoxic T lymphocytes and efficacy for adoptive immunotherapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 4102-4107 (1996).

Play Video

Cite This Article
Di Carluccio, A. R., Tresoldi, E., So, M., Mannering, S. I. Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester. J. Vis. Exp. (148), e59545, doi:10.3791/59545 (2019).

View Video