Proliferasyon ınsan antijeni spesifik CD4+ T hücrelerinin Karboksflorcein Succinimidyl Ester kullanarak ölçülmesini
Summary
Burada sunulan bir protokol Proliferasyona CD4+ T hücreleri antijenik proteinler veya peptidler boya seyreltme kullanarak yanıt olarak. Bu tahlil nadir antijen özgü T hücrelere özellikle duyarlıdır ve antijen özgü hücrelerin klonlama kolaylaştırmak için değiştirilebilir.
Abstract
Açıklanan basit, in vitro, boya seyreltme tabanlı yöntem antijen spesifik CD4+ T hücre proliferasyonu insan periferik kan mononükleer hücrelerde (PBMCs). Karboksfloresan succinimidil Ester (CFSE) gibi istikrarlı, toksik olmayan, floresan boyaların geliştirilmesi, nadir, antijen spesifik T hücrelerinin, Akış sitometrisi tarafından algılandığı gibi floresan renkte azalan şekilde seyircilerden ayırt edilmesini sağlar. Bu yöntem, alternatif yaklaşımlar üzerinde aşağıdaki avantajlara sahiptir: (i) düşük frekanslı T hücrelerine çok duyarlıdır, (ii) antijen veya epitopu bilgisi gerektirmez, (iii) yanıt veren hücrelerin fenotipi analiz edilebilir, ve (iv) uygulanabilir, yanıt hücreler sıralanabilir ve T hücresi klonlama gibi daha fazla analiz için kullanılabilir.
Introduction
Antijen spesifik T hücrelerini tespit etme ve çalışma yeteneği, hücre aracılı bağışıklık çalışmalarında önemlidir. Ancak, bunu yapmak özellikle, çok zayıf ve algılamak zor olan otoantijen spesifik CD4+ T-Cell yanıtları için zordur. Antijen spesifik lenfosit proliferasyonu tespiti için kullanılan ortak bir yöntem, proliferasyon hücrelerinin DNA ‘sına dahil edilmiş radyoaktif nüklenotid olan [3H]-thymidine ‘ dir. Rağmen [3H]-thymidine tahlil DNA sentezini algılayabilir, bu yöntem hücre bölünmesi dolaylı bir ölçüsüdür, çünkü DNA sentezi mitoz bağımsız olarak başlatabilirsiniz (yani, gen çoğaltma ve Apoptozis sırasında1). Bu sorun, hücrelerin antijen spesifik proliferasyonu önemli apoptozis2, antijen spesifik proliferasyon potansiyel aşırı tahminine yol açabileceği gerçeğini tarafından bileşik olduğunu. Ayrıca, [3H]-thymidine yöntemi proliferasyon lenfositler için fenotipik bilgi sağlamaz, gibi CD4+ veya CD8+ Lineage proliferasyonu pbmcs antijenik peptitler ile uyarılmış.
2003 yılında, cfse kullanarak ilk boya seyreltme assay yayımlandı, cfse tabanlı proliferasyon tahlil3,4çağırdı. CFSE, hücre içi lizin kalıntıları için bir kovalent bağ oluşturarak hücre içi proteinlere tutarlı bir şekilde bağlanan bir floresan boydır. Cfse etiketli proteinler, kız hücreleri3‘ e eşit olarak bölünmüş olduğundan, bölünmüş hücreler bölünmüş hücrelerden akış sitometri tarafından ayırt edilebilir, bu da lenfosit nüfus niceliksel fenotiplemeyi için izin verir. Nitekim, bir hücrenin CFSE-stainıng zamandan gelen bölünmelerin sayısı bir dereceye kadar ölçülebilir5. Daha yakın zamanda, CellTrace Violet proliferasyon boya (VPD) ve CytoTrack boya gibi pek çok benzer boyalar geliştirilmiştir, hangi benzer şekilde çalışır6. Bu protokol CFSE odaklanır, ancak ilkeler diğer ilgili boyalar için eşit olarak geçerlidir.
Peptid-MHC tetramer boyama antijen spesifik CD8+ T hücrelerini tespit etmek ve klonlamak için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Bu iyi kurulan bir yöntem7,8,9,10; Ancak tetramer tabanlı klonlama, epitopu/MHC kısıtlamasının mevcut bilgisini gerektirir ve her epitopu, epitopu spesifik T hücrelerinin yeni keşfi ve klonlaması kapsamını sınırlayan kendi tetramer11‘ i gerektirir. CFSE tabanlı proliferasyon peptidler, proteinler veya hücre Lysates ile kullanılabilir. Burada açıklanan protokol hem basit hem de sağlam olup, yanıt veren CD4+ T hücrelerinin aşağı akım fonksiyonel ve biyokimyasal karakterizasyon olarak kullanılmak üzere sıralanması12,13.
Protocol
Representative Results
Discussion
CFSE tabanlı proliferasyon tespit ve antijen özgü insan CD4+ T hücreleri numaralandırılması için basit ve sağlam bir yöntemdir. Daha önce en iyi sonuçlar için CFSE optimum konsantrasyon kullanarak gerekli olduğunu göstermiştir4. Çok fazla cfse CPAP proliferasyon, çok az bölünmüş ve bölünmüş hücreleri ayırt etmek için izin vermez ancak. Aksine, CFSE nispeten yüksek konsantrasyonlarda (5,0 μM) arıtılmış murine T hücreleri etiket için kullanılır<sup c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma tarafından desteklenmektedir: juvenil diyabet araştırma Vakfı [JDRF 5-CDA-2014-210-A-N] (S. M.). Ulusal Sağlık ve Tıp Araştırma Konseyi (NHMRC GNT123586) (S. M.), diyabet Avustralya araştırma güven Milenyum Ödülü (Y17M1-MANS) (S. M.), Viktorya hükümeti ‘nin operasyonel altyapı destek programı (S. M., A. D., E. T., M. S.) ve NHMRC Lisansüstü Burs APP1094337 ve JDRF doktora Top-Up burs (M. S.).
Materials
| Anti-human CD4-AlexaFluor647 | Biolegend | 317422 | RRID:AB_2716180 |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | ThermoFisher | C1157 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 71-7167-00 | |
| Glutamax (1x) | Gibco | 35050 | |
| Influenza A H1N1 (PR8) Matrix protein 1 | Sino Biological | 40010-V07E | |
| Non-Essential amino acids (1x) | Gibco | 11140 | |
| Penicillin/ Streptomycin (1x) | Gibco | 15070063 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Pooled human serum | Australian Red Cross | N/A | |
| Proinsulin C-peptide PI33-63 | Purar Chemicals | N/A | Custom made synthetic peptide |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Tetanus Toxoid protein | Statens Serum Intitut | N/A |
References
- Duque, A., Rakic, P. Different effects of BrdU and 3H-Thymidine incorporation into DNA on cell proliferation, position and fate. Journal of Neuroscience. 31, 15205-15217 (2011).
- Mannering, S. I., Zhong, J. I. E., Cheers, C. T-cell activation, proliferation and apoptosis in primary Listeria monocytogenes infection. Immunology. 106, 87-95 (2002).
- Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 171, 131-137 (1994).
- Mannering, S. I., et al. A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells. Journal of Immunological Methods. 283, 173-183 (2003).
- Quah, B. J. C., Parish, C. R. The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation. Journal of Visualized Experiments. , 4-7 (2010).
- Ten Brinke, A., et al. Monitoring T-cell responses in translational studies: Optimization of dye-based proliferation assay for evaluation of antigen-specific responses. Frontiers in Immunology. 8, 1-15 (2017).
- Gillespie, G. M. A., et al. Strong TCR Conservation and Altered T Cell Cross-Reactivity Characterize a B*57-Restricted Immune Response in HIV-1 Infection. Journal of Immunolgy. 177, 3893-3902 (2006).
- Tynan, F. E., et al. High Resolution Structures of Highly Bulged Viral Epitopes Bound to Major Histocompatibility Complex Class I: Implications for t-cell receptor engagement and t-cell immunodominance. Journal of Biological Chemistry. 280, 23900-23909 (2005).
- Blanchard, N., et al. Endoplasmic reticulum aminopeptidase associated with antigen processing defines the composition and structure of MHC class I peptide repertoire in normal and virus-infected cells. Journal of Immunology. 184, 3033-3042 (2010).
- Glanville, J., et al. Identifying specificity groups in the T cell receptor repertoire repertoire. Nature. 547, 94-98 (2017).
- Wooldridge, L., et al. Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide MHC. Immunology. 126, 147-164 (2009).
- Mannering, S. I., et al. An efficient method for cloning human autoantigen-specific T cells. Journal of Immunological Methods. 298, 83-92 (2005).
- So, M., et al. Proinsulin C-peptide is an autoantigen in people with type 1 diabetes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (2018).
- Hui-Yuen, J., Mcallister, S., Koganti, S., Hill, E., Bhaduri-Mcintosh, S. Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines. Journal of Visualized Experiments. , 2-7 (2011).
- Alexander-Miller, M. A., Leggatt, G. R., Berzofsky, J. A., Moss, B. Selective expansion of high or low avidity cytotoxic T lymphocytes and efficacy for adoptive immunotherapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 4102-4107 (1996).
