Dråbe digital TRAP (ddTRAP): tilpasning af telomere REPEAT forstærknings protokol til droplet digital polymerase kædereaktion
Summary
Vi har med succes konverteret standard telomere gentagelse forstærknings protokol (TRAP) assay, der skal anvendes i dråbe digitale polymerase kædereaktioner. Denne nye analyse, kaldet ddTRAP, er mere følsom og kvantitativ, giver mulighed for bedre påvisning og statistisk analyse af telomerase aktivitet inden for forskellige humane celler.
Abstract
Telomere REPEAT-forstærknings protokollen (TRAP) er den mest udbredte analyse til påvisning af telomeraseaktivitet inden for en given prøve. Den polymerasekæde reaktion (PCR)-baserede metode giver mulighed for robuste målinger af enzymaktivitet fra de fleste celle lysater. Den gel-baserede Trap med optælling mærkede primere begrænser prøve gennemløb, og evnen til at detektere forskelle i prøver er begrænset til to gange eller større ændringer i enzymaktivitet. Den dråbe digital TRAP, ddTRAP, er en meget følsom tilgang, der er blevet modificeret fra den traditionelle TRAP-analyse, der gør det muligt for brugeren at udføre en robust analyse på 96 prøver pr. løb og opnå absolut kvantificering af DNA (telomerase forlængelse produkter ) input inden for hver PCR. Derfor overvinder den nyudviklede ddTRAP-analyse begrænsningerne ved den traditionelle gel-baserede TRAP-analyse og giver en mere effektiv, nøjagtig og kvantitativ tilgang til måling af telomeraseaktivitet inden for laboratorie-og kliniske miljøer.
Introduction
Telomeres er dynamiske DNA-protein komplekser i enderne af lineære kromosomer. Human telomerer består af en række 5 ‘-ttagggn hexameric gentagelser, som varierer i længde mellem 12 – 15 kilo baser (KB) ved fødslen1. Humant telomerase, ribonucleoprotein enzym, der vedligeholder telomerer, blev først identificeret i Hela celle lysaterne (kræft cellelinje)2. Tilsammen spiller telomerer og telomerase en vigtig rolle i et spektrum af biologiske processer som genombeskyttelse, genregulering og kræftcellers udødelighed3,4,5,6.
Human telomerase består primært af to nøglekomponenter, nemlig telomerase reverse transkriptase og telomerase RNA (henholdsvis hTERT og hTERC). Protein-under enheden, hTERT, er den katalytisk aktive reverse transkriptase-komponent i telomeraseenzymet. RNA-skabelonen, hTERC, giver telomerase med skabelonen til at udvide og/eller vedligeholde telomeres. De fleste humane somatiske væv har ingen påviselige telomerase aktivitet. Den manglende evne af DNA-Polymerase til at forlænge slutningen af den halter streng af DNA sammen med manglen på telomerase fører til den progressive forkortelse af telomerer efter hver runde af cellulære division. Disse fænomener fører til telomere forkortelse i de fleste somatiske celler, indtil de når en kritisk forkortet længde, hvor cellerne indtaster en tilstand af replikativ senescens. Det maksimale antal gange en celle kan opdele er dikteret af sin telomere længde og denne blok til fortsat celle division menes at forhindre progression til oncogenesis7. Kræftceller er i stand til at overvinde telomere-induceret replikativ senescens og fortsætte med at formere ved at udnytte telomerase at opretholde deres telomerer. Ca 90% af kræftformer aktivere telomerase, gør telomerase aktivitet kritisk vigtigt i både kræft påvisning og behandling.
Udviklingen af TRAP-analysen i 1990 ‘ erne var medvirkende til at identificere de nødvendige komponenter af telomeraseenzymet samt til måling af telomerase i en lang række celler og væv, både normale og kræftrelaterede. Den oprindelige gel-baserede PCR-analyse anvendte radioaktivt mærkede DNA-substrater til at detektere telomeraseaktivitet. I 2006 blev analysen tilpasset til en ikke-radioaktiv form ved hjælp af optælling mærket substrater8,9. Ved at bruge optælling mærket substrater, brugere var i stand til at visualisere telomerase udvidelse produkter som bands på en gel ved at udsætte det til den korrekte excitation bølgelængde. Følsomheden af TRAP-analysen og dens evne til at detektere telomeraseaktivitet i rå celle lysater har gjort denne analyse den mest udbredte metode til telomerase aktivitet påvisning. TRAP-analysen har dog begrænsninger. Analysen er gel-baseret, hvilket gør det vanskeligt at udføre de nødvendige replikater i moderat til høj-gennemløb undersøgelser, og dermed korrekt statistisk analyse er sjældent opnået. Desuden er det gel-baserede assay vanskeligt at kvantificere pålideligt på grund af manglende evne til at påvise mindre end to forskelle i telomeraseaktiviteten mellem prøverne. Overvinde disse to begrænsninger er afgørende for enzymatiske aktivitet analyser såsom Trap at flytte til kliniske eller industrielle indstillinger for påvisning af telomerase aktivitet i patientprøver eller Drug Design undersøgelser.
Digital PCR blev oprindeligt udviklet i 1999 som et middel til at omdanne den eksponentielle og analoge karakter af PCR til en lineær og digital assay10. Droplet digital PCR (ddPCR) er den seneste nyskabelse i den oprindelige digitale PCR-metodologi. Droplet digital PCR kom om med fremkomsten af avancerede mikrofluidics og olie-i-vand emulsion kemi til pålideligt generere stabile og lige store dråber. I modsætning til gel-baseret og endda kvantitativ PCR (qPCR) genererer ddPCR absolut kvantificering af input materialet. Nøglen til ddPCR er dannelsen af ~ 20.000 individuelle reaktioner ved at partitionere prøver i dråber. Efter slutpunkt PCR scanner dråbe læseren hver dråbe i en flow-cytometer-lignende mode, tælle, dimensionering, og registrere tilstedeværelsen eller fravær af fluorescens i hver enkelt dråbe (dvs. fravær eller tilstedeværelse af PCR amplikoner i hver dråbe). Derefter, ved hjælp af Poisson ‘ s fordeling, input molekyler er anslået baseret på forholdet mellem positive dråber til det samlede antal dråber. Dette tal repræsenterer et estimat af antallet af indgangs molekyler i hver PCR. Desuden, ddPCR udføres og analyseres på en 96-brønd plade, som giver brugeren mulighed for at køre mange prøver, samt udføre biologiske og tekniske replikater til korrekt statistisk analyse. Som et resultat, vi har kombineret den kraftige kvantificering og moderat-gennemløb karakter af ddPCR med TRAP-analysen til at udvikle ddTRAP assay11. Denne analyse er designet til brugere til at studere og robust kvantificere absolutte telomerase aktivitet fra biologiske prøver11,12. DdTRAP-følsomheden gør det muligt at kvantificere telomeraseaktivitet fra begrænsede og dyrebare prøver, herunder enkelt celle målinger. Endvidere, brugere kan også studere virkningerne af telomerase manipulationer og/eller narkotika med absolut kvantificering af mindre end to ændringer (~ 50% forskelle). DdTRAP er den naturlige udvikling af TRAP-analysen i den digitale og højere gennemløb karakter af moderne laboratorie eksperimenter og kliniske indstillinger.
Protocol
Representative Results
Discussion
Målingen af telomerase aktivitet er afgørende for en overflod af forskningsemner, herunder, men ikke begrænset til, kræft, telomere biologi, aldring, regenerativ medicin, og struktur-baseret Drug design. Telomerase RNPs er lav rigelige, selv i kræftceller, hvilket gør påvisning og undersøgelse af dette enzym udfordrende. I dette papir, beskrev vi trin-for-trin procedurer for den nyudviklede ddTRAP analyse til robust kvantificere telomerase aktivitet i celler. Ved at kombinere den traditionelle telomerase forlæng…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne anerkende finansieringskilder fra de nationale sundhedsinstitutter (NIH) (NIC-r00-CA197672-01A1). Små celle lungecancer linjer (SHP77 og H82) var en generøs gave fra DRs. John Minna og ADI Gazdar fra UT Southwestern Medical Center.
Materials
| 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Ambion | AM9855G | RNAse/DNAse free |
| 1 M MgCl2 | Ambion | AM9530G | RnAse/DNAse free |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Ambion | AM9261 | RNAse/DNAse free |
| Surfact- Amps NP-40 | Thermo Scientific | 28324 | |
| 100% Ultrapure Glycerol | Invitrogen | 15514011 | RNAse/DNAse free |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Thermo Scientific | 36978 | Powder |
| 2-Mercaptoethanol | SIGMA-ALDRICH | 516732 | |
| Nuclease Free H20 | Ambion | AM9932 | RNAse/DNAse free |
| 2.5 mM dNTP mix | Thermo Scientific | R72501 | 2.5 mM of each dATP, dCTP, dGTP and dTTP |
| 2 M KCl | Ambion | AM9640G | RNAse/DNAse free |
| 100% Tween-20 | Fisher | 9005-64-5 | |
| 0.5 M EGTA pH 8.0 | Fisher | 50-255-956 | RNAse/DNAse free |
| Telomerase Substrate (TS) Primer | Integrated DNA Technology (IDT) | Custom Primer (HPLC Purified) | 5'- AATCCGTCGAGCAGAGTT-3' |
| ACX (Revers) Primer | Integrated DNA Technology (IDT) | Custom Primer (HPLC Purified) | 5'- GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC -3' |
| Thin walled (250 ul) PCR grade tubes | USA Scientific | 1402-2900 | strips, plates, tubes etc. |
| QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | Bio Rad | 1864034 | |
| Twin-Tec 96 Well Plate | Fisher | Eppendorf 951020362 | |
| Piercable foil heat seal | Bio Rad | 1814040 | |
| Droplet generator cartidges (DG8) | Bio Rad | 1863008 | |
| Droplet generator oil | Bio Rad | 1863005 | |
| Droplet generator gasket | Bio Rad | 1863009 | |
| 96-well Thermocycler T100 | Bio Rad | 1861096 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio Rad | 1814000 | |
| QX200 Droplet Reader and Quantasoft Software | Bio Rad | 1864001 and 1864003 | |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio Rad | 1863004 | |
| Nuclease Free Filtered Pipette Tips | Thermo Scientific | 10 ul, 20 ul , 200 ul and 1000 ul |
References
- Frenck, R. W., Blackburn, E. H., Shannon, K. M. The rate of telomere sequence loss in human leukocytes varies with age. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (10), 5607-5610 (1998).
- Morin, G. B. The human telomere terminal transferase enzyme is a ribonucleoprotein that synthesizes TTAGGG repeats. Cell. 59 (3), 521-529 (1989).
- de Lange, T. How telomeres solve the end-protection problem. Science. 326 (5955), 948-952 (2009).
- Shay, J. W., Wright, W. E. Role of telomeres and telomerase in cancer. Seminars in Cancer Biology. 21 (6), 349-353 (2011).
- Kim, W., Shay, J. W. Long-range telomere regulation of gene expression: Telomere looping and telomere position effect over long distances (TPE-OLD). Differentiation. 99, 1-9 (2018).
- Robin, J. D., et al. Telomere position effect: regulation of gene expression with progressive telomere shortening over long distances. Genes Development. 28 (22), 2464-2476 (2014).
- Shay, J. W., Wright, W. E. Senescence and immortalization: role of telomeres and telomerase. Carcinogenesis. 26 (5), 867-874 (2005).
- Norton, J. C., Holt, S. E., Wright, W. E., Shay, J. W. Enhanced detection of human telomerase activity. DNA Cell Biology. 17 (3), 217-219 (1998).
- Herbert, B. S., Hochreiter, A. E., Wright, W. E., Shay, J. W. Nonradioactive detection of telomerase activity using the telomeric repeat amplification protocol. Nature Protocols. 1 (3), 1583-1590 (2006).
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (16), 9236-9241 (1999).
- Ludlow, A. T., et al. Quantitative telomerase enzyme activity determination using droplet digital PCR with single cell resolution. Nucleic Acids Research. 42 (13), e104 (2014).
- Huang, E. E., et al. The Maintenance of Telomere Length in CD28+ T Cells During T Lymphocyte Stimulation. Scientific Reports. 7 (1), 6785 (2017).
- Ludlow, A. T., Shelton, D., Wright, W. E., Shay, J. W. ddTRAP: A Method for Sensitive and Precise Quantification of Telomerase Activity. Methods Molecular Biology. 1768, 513-529 (2018).
