PIÈGE numérique de gouttelettes (ddTRAP): adaptation du protocole de répétition d’amplification de télomère à la réaction en chaîne de la polymérase numérique des gouttelettes
Summary
Nous avons réussi à convertir le test de protocole d’amplification de télomère standard (TRAP) pour être utilisé dans les réactions en chaîne de la polymérase numérique des gouttelettes. Ce nouveau dosage, appelé ddTRAP, est plus sensible et quantitatif, ce qui permet une meilleure détection et analyse statistique de l’activité de la télomérase dans diverses cellules humaines.
Abstract
Le protocole de répétition d’amplification de télomère (TRAP) est le dosage le plus couramment utilisé pour détecter l’activité de télomérase dans un échantillon donné. La méthode de la réaction en chaîne de la polymérase (PCR) permet des mesures robustes de l’activité enzymatique de la plupart des lysats cellulaires. Le piège à base de gel avec des amorces fluorescemment étiquetés limite le débit de l’échantillon, et la capacité de détecter les différences dans les échantillons est limitée à deux fois ou plus de changements dans l’activité enzymatique. La gouttelette Digital TRAP, ddTRAP, est une approche très sensible qui a été modifiée à partir du test TRAP traditionnel, permettant à l’utilisateur d’effectuer une analyse robuste sur 96 échantillons par Run et d’obtenir une quantification absolue de l’ADN (produits d’extension télomérase ) entrée dans chaque PCR. Par conséquent, le test ddTRAP nouvellement développé surpasse les limites du dosage traditionnel à base de gel et fournit une approche plus efficace, précise et quantitative pour mesurer l’activité de la télomérase dans les milieux de laboratoire et cliniques.
Introduction
Les télomères sont des complexes d’ADN-protéine dynamique aux extrémités des chromosomes linéaires. Les télomères humains sont composés d’un tableau de répétitions de 5 ‘-TTAGGGn hexamériques qui varient en longueur entre 12 – 15 kilobases (KB) à la naissance1. La télomérase humaine, l’enzyme ribonucléoprotéique qui maintient les télomères, a été identifiée pour la première fois dans les lysats cellulaires de HeLa (lignée de cellules cancéreuses)2. Ensemble, télomères et télomérase jouent un rôle majeur dans un spectre de processus biologiques tels que la protection du génome, la régulation génique et l’immortalité des cellules cancéreuses3,4,5,6.
La télomérase humaine se compose principalement de deux composants clés, à savoir la transcriptase inverse télomérase et l’ARN télomérase (hTERT et hTERC, respectivement). La sous-unité protéique, hTERT, est la composante catalytiquement active de la transcriptase inverse de l’enzyme télomérase. Le modèle d’ARN, hTERC, fournit la télomérase avec le modèle pour étendre et/ou entretenir des télomères. La plupart des tissus somatiques humains n’ont pas d’activité de télomérase détectable. L’incapacité de l’ADN polymérase à prolonger la fin du brin d’ADN en retard avec l’absence de télomérases conduit au raccourcissement progressif des télomères après chaque tour de division cellulaire. Ces phénomènes conduisent au raccourcissement du télomère dans la plupart des cellules somatiques jusqu’à ce qu’ils atteignent une longueur critique raccourcie, par laquelle les cellules entrent dans un état de sénescence réplicative. Le nombre maximal de fois qu’une cellule peut se diviser est dicté par sa longueur de télomère et ce bloc à la division cellulaire continue est pensé pour empêcher la progression à l’oncogenèse7. Les cellules cancéreuses sont capables de surmonter la sénescence réplicative induite par le télomère et continuent de prolirer en utilisant la télomérase pour maintenir leurs télomères. Environ 90% des cancers activent la télomérase, rendant l’activité de la télomérase extrêmement importante dans la détection et le traitement du cancer.
Le développement de l’essai TRAP dans les années 1990 a joué un rôle déterminant dans l’identification des composants nécessaires de l’enzyme télomérase, ainsi que dans la mesure de la télomérase dans un large éventail de cellules et de tissus, normaux et cancéreux. Le dosage d’origine par PCR à base de gel utilisait des substrats d’ADN étiquetés radioactivement pour détecter l’activité de la télomérase. En 2006, le dosage a été adapté dans une forme non radioactive à l’aide de substrats marqués fluorescemment8,9. En utilisant des substrats marqués fluorescemment, les utilisateurs ont pu visualiser les produits d’extension de télomérase sous forme de bandes sur un gel en l’exposant à la longueur d’onde d’excitation correcte. La sensibilité du test TRAP et sa capacité à détecter l’activité de la télomérase dans les lysats cellulaires bruts ont fait de ce test la méthode la plus couramment utilisée pour la détection d’activité de télomérase. Cependant, le test TRAP a des limitations. Le dosage est à base de gel, ce qui rend difficile l’exécution des répétitions nécessaires dans des études de rendement modéré à élevé, et donc, une analyse statistique appropriée est rarement obtenue. En outre, le dosage à base de gel est difficile à quantifier de façon fiable en raison de l’incapacité de détecter moins de deux différences dans l’activité de la télomérase entre les échantillons. Surmonter ces deux limitations est essentiel pour les essais d’activité enzymatique tels que le piège pour passer à des paramètres cliniques ou de l’industrie pour la détection de l’activité télomérase dans des échantillons de patients ou des études de conception de médicaments.
La PCR numérique a été initialement développée en 1999 comme un moyen de convertir la nature exponentielle et analogique de la PCR en un test linéaire et numérique10. La PCR numérique par gouttelettes (ddPCR) est l’innovation la plus récente de la méthodologie de PCR numérique originale. La PCR numérique par gouttelettes est venue avec l’avènement des microfluidique avancés et de la chimie de l’émulsion d’huile dans l’eau pour générer de façon fiable des gouttelettes stables et de taille égale. Contrairement à la PCR à base de gel et même quantitative (qPCR), ddPCR génère une quantification absolue du matériau d’entrée. La clé de ddPCR est la génération de ~ 20 000 réactions individuelles en divisant les échantillons en gouttelettes. Après la PCR de point final, le lecteur de gouttelettes analyse chaque gouttelette dans un flux-cytomètre-comme la mode, le comptage, le dimensionnement, et l’enregistrement de la présence ou l’absence de fluorescence dans chaque gouttelette individuelle (c.-à-d., l’absence ou la présence d’amplicons PCR dans chaque gouttelette). Ensuite, en utilisant la distribution de poisson, les molécules d’entrée sont estimées en fonction du rapport entre les gouttelettes positives et le nombre total de gouttelettes. Ce nombre représente une estimation du nombre de molécules d’entrée dans chaque PCR. En outre, le ddPCR est exécuté et analysé sur une plaque de 96-Well qui permet à l’utilisateur d’exécuter de nombreux échantillons, ainsi que d’effectuer des répliques biologiques et techniques pour une analyse statistique appropriée. En conséquence, nous avons combiné la puissante quantification et la nature à débit modéré de ddPCR avec le test TRAP pour développer le dosage ddTRAP11. Ce dosage est conçu pour que les utilisateurs étudient et quantifient vigoureusement l’activité de télomérase absolue à partir d’échantillons biologiques11,12. La sensibilité du ddTRAP permet la quantification de l’activité télomérase à partir d’échantillons limités et précieux, y compris des mesures à une seule cellule. En outre, les utilisateurs peuvent également étudier les effets des manipulations de télomérase et/ou des médicaments avec une quantification absolue de moins de deux changements (~ 50% différences). Le ddTRAP est l’évolution naturelle du test TRAP dans la nature numérique et à plus haut débit des expériences de laboratoire modernes et des paramètres cliniques.
Protocol
Representative Results
Discussion
La mesure de l’activité télomérase est essentielle à une pléthore de sujets de recherche, y compris, mais sans s’y limiter, le cancer, la biologie télomère, le vieillissement, la médecine régénérative, et la conception de médicaments à base de structure. Les RNPs de télomérase sont faibles abondants, même dans les cellules cancéreuses, rendant la détection et l’étude de cette enzyme provocante. Dans cet article, nous avons décrit les procédures étape par étape pour le nouveau dosage ddTRAP af…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs aimeraient reconnaître les sources de financement des instituts nationaux de santé (NIH) (NCI-R00-CA197672-01A1). Les lignées de cancer du poumon à petites cellules (SHP77 et H82) étaient un don généreux des Drs John Minna et ADI Gazdar du centre médical du sud-ouest de l’UT.
Materials
| 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Ambion | AM9855G | RNAse/DNAse free |
| 1 M MgCl2 | Ambion | AM9530G | RnAse/DNAse free |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Ambion | AM9261 | RNAse/DNAse free |
| Surfact- Amps NP-40 | Thermo Scientific | 28324 | |
| 100% Ultrapure Glycerol | Invitrogen | 15514011 | RNAse/DNAse free |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Thermo Scientific | 36978 | Powder |
| 2-Mercaptoethanol | SIGMA-ALDRICH | 516732 | |
| Nuclease Free H20 | Ambion | AM9932 | RNAse/DNAse free |
| 2.5 mM dNTP mix | Thermo Scientific | R72501 | 2.5 mM of each dATP, dCTP, dGTP and dTTP |
| 2 M KCl | Ambion | AM9640G | RNAse/DNAse free |
| 100% Tween-20 | Fisher | 9005-64-5 | |
| 0.5 M EGTA pH 8.0 | Fisher | 50-255-956 | RNAse/DNAse free |
| Telomerase Substrate (TS) Primer | Integrated DNA Technology (IDT) | Custom Primer (HPLC Purified) | 5'- AATCCGTCGAGCAGAGTT-3' |
| ACX (Revers) Primer | Integrated DNA Technology (IDT) | Custom Primer (HPLC Purified) | 5'- GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC -3' |
| Thin walled (250 ul) PCR grade tubes | USA Scientific | 1402-2900 | strips, plates, tubes etc. |
| QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | Bio Rad | 1864034 | |
| Twin-Tec 96 Well Plate | Fisher | Eppendorf 951020362 | |
| Piercable foil heat seal | Bio Rad | 1814040 | |
| Droplet generator cartidges (DG8) | Bio Rad | 1863008 | |
| Droplet generator oil | Bio Rad | 1863005 | |
| Droplet generator gasket | Bio Rad | 1863009 | |
| 96-well Thermocycler T100 | Bio Rad | 1861096 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio Rad | 1814000 | |
| QX200 Droplet Reader and Quantasoft Software | Bio Rad | 1864001 and 1864003 | |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio Rad | 1863004 | |
| Nuclease Free Filtered Pipette Tips | Thermo Scientific | 10 ul, 20 ul , 200 ul and 1000 ul |
References
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