Wir haben erfolgreich den Standard-Telomere-Wiederholungsverstärkungsprotokoll (TRAP) umgebaut, der in Tröpfchenspolonen-Kettenreaktionen eingesetzt werden soll. Dieser neue Test, genannt ddTRAP, ist sensibler und quantitativer, was eine bessere Erkennung und statistische Analyse der Telomeraseaktivität in verschiedenen menschlichen Zellen ermöglicht.
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Methodenartikel
Tröpfchendigital TRAP (ddTRAP): Anpassung des Telomere Repeat Amplification Protocol an die Reaktion auf die digitale Polymerase Chain Reaction
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Das Telomere-Wiederholungsverstärkungsprotokoll (TRAP) ist der am weitesten verbreitete Test, um Telomeraseaktivität innerhalb einer bestimmten Probe zu erkennen. Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-basierte Methode ermöglicht robuste Messungen der Enzymaktivität von den meisten Zelllysaten. Der gelbasierte TRAP mit fluoreszierend gekennzeichneten Primern begrenzt den Probendurchsatz, und die Fähigkeit, Unterschiede in Proben zu erkennen, ist auf zwei oder größere Veränderungen in der Enzymaktivität beschränkt. Der Tröpfchendigital TRAP, ddTRAP, ist ein hochsensibler Ansatz, der vom traditionellen TRAP-Test modifiziert wurde und es dem Anwender ermöglicht, eine robuste Analyse von 96 Proben pro Lauf durchzuführen und eine absolute Quantifizierung der DNA zu erhalten (Telomerase Extension Produkte). ) Eingaben in jeder PCR. Der neu entwickelte ddTRAP-Test überwindet daher die Grenzen des traditionellen gelbasierten TRAP-Tests und bietet einen effizienteren, präziseren und quantitativen Ansatz zur Messung der Telomerasaktivität im Labor und in klinischen Umgebungen.
Einleitung
Telomere sind dynamische DNA-Proteinkomplexe an den Enden linearer Chromosomen. Menschliche Telomere bestehen aus einem Array von 5 '-TTAGGGn hexamerischen Wiederholungen, die bei der Geburt1in der Länge zwischen 12 – 15 Kilobasen (kb) variieren. Das menschliche Telomerase, das Ribonucleoprotein-Enzym, das die Telomere unterhält, wurde erstmals in HeLa-Zell-Lysaten (Krebszelllinie) 2 identifiziert. Telomere und Telomerase spielen zusammen eine große Rolle in einem Spektrum biologischer Prozesse wie Genomschutz, Genregulation und Krebszellunsterblichkeit3
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Protokoll
1. Puffervorbereitung und-lagerung
- Bereiten Sie 50 mL von 1x vorrätig RNase-/DNase-freien NP-40-Lysepuffer (10 mM Tris-HCl [pH 8.0], 1 mM MgCl 2, 1 mM Ethylenediaminetetraacetikinsäure (EDTA), 1% [vol/vol] NP-40,10% Glycerol, 150 mM NaCl, 5 mM β-mercaptoethanol, und 0,1 mM 4- Benzesulfonyl Fluorid Hydrochlorid (AEBSF)). Dieser Puffer kann für die zukünftige Nutzung bei-20 ° C alitiert und gespeichert werden. Vermeiden Sie Gefrierpunkte, um eine optimale Lyse der Zellen zu erhalten.
- Bereiten Sie 50 mL von 10x vorrätiger RNase-/DNase-freier TRAP-Erweiterungspuffer (200 mM Tris-HCl [pH 8.0] vor,15 mM MgCl 2,630 mM KCl, 0,5% [vol/....
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Ergebnisse
Mit dem ddTRAP, Die Telomerase-Aktivität wurde in einer Zelltafel gemessen, die aus folgenden Zelllinien besteht (Abbildung1): Nicht-kleinzelliger Lungenkrebs (H2882, H1299, Calu6, H920, A549 und H2887), Klassenturfaltenkrebs (H82 und SHP77) und Telomerase-negativ Fibroblasten (BJ). Eine Million Zellpellets wurden im NP-40-Puffer lysisiert, und Telomerase-Verlängerungsreaktionen wurden in biologischen Triplikaten durchgeführt. Eine gängige und sehr empfohlene.......
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Diskussion
Die Messung der Telomeraseaktivität ist für eine Vielzahl von Forschungsthemen von entscheidender Bedeutung, darunter Krebs, Telomerbiologie, Alterung, regenerative Medizin und strukturbasiertes Arzneimitteldesign. Telomerase RNPs sind sehr reichlich vorhanden, auch in Krebszellen, was die Erkennung und Untersuchung dieses Enzyms herausfordernd macht. In diesem Beitrag beschrieben wir die schrittweisen Verfahren für den neu entwickelten ddTRAP-Test, um die Telomerase-Aktivität in Zellen robust zu quantifizieren. Durch di.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Die Autoren möchten Förderquellen der National Institutes of Health (NIH) (NCI-R00-CA197672-01A1) anerkennen. Kleine Lungenkrebslinien (SHP77 und H82) waren ein großzügiges Geschenk von Dr. John Minna und Adi Gazdar vom UT Southwestern Medical Center.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 1 M Tris-HCl pH 8,0 | Ambion | AM9855G | RNAse/DNAsefrei |
| 1 M MgCl2 | Ambion | AM9530G | RnAse/DNAsefrei |
| 0,5 M EDTA pH 8,0 | Ambion | AM9261 | RNAse/DNAsefrei |
| Surfact-Amps NP-40 | Thermo Scientific | 28324 | |
| 100% ultrareines Glycerin | Invitrogen | 15514011 | RNAse/DNAsefrei |
| Phenylmethylsulfonylfluorid | Thermo Scientific | 36978 | Pulver |
| 2-Mercaptoethanol | SIGMA-ALDRICH | 516732 | |
| Nukleasefrei H20 | Ambion | AM9932 | RNAse/DNAse frei |
| 2,5 mM dNTP-Mischung | Thermo Scientific | R72501 | 2,5 mM von je dATP, dCTP, dGTP und dTTP |
| 2 M KCl | Ambion | AM9640G | RNAse/DNAse frei |
| 100% Tween-20 | Fisher | 9005-64-5 | |
| 0,5 M EGTA pH 8,0 | Fisher | 50-255-956 | RNAse/DNAse-freies |
| Telomerase-Substrat (TS) Primer | Integrierte DNA-Technologie (IDT)Kundenspezifischer | Primer (HPLC aufgereinigt) | 5' - AATCCGTCGAGCAGAGTT-3'ACX |
| (Revers) Primer | Integrierte DNA-Technologie (IDT) | Kundenspezifischer Primer (HPLC aufgereinigt) | 5'- GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC - |
| 3'Dünnwandige (250 ul) PCR-Grade Röhrchen | USA Scientific | 1402-2900 | Streifen, Platten, Röhrchen etc. |
| QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | Bio Rad | 1864034 | |
| Twin-Tec 96 Well Plate | Fisher | Eppendorf 951020362 | |
| Durchstechbare Folie Heißsiegel | Bio Rad | 1814040 | |
| Tröpfchengenerator Kartuschen (DG8) | Bio Rad | 1863008 | |
| Tröpfchengenerator Öl | Bio Rad | 1863005 | |
| Tröpfchengenerator Dichtung | Bio Rad | 1863009 | |
| 96-Well-Thermocycler T100 | Bio Rad | 1861096 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio Rad | 1814000 | |
| QX200 Droplet Reader und Quantasoft Software | Bio Rad | 1864001 und 1864003 | |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio Rad | 1863004 | |
| Nukleasefrei gefilterte Pipettenspitzen | Thermo Wissenschaftlich | 10 ul, 20 ul , 200 ul und 1000 ul |
Referenzen
- Frenck, R. W. Jr, Blackburn, E. H., Shannon, K. M. The rate of telomere sequence loss in human leukocytes varies with age. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (10), 5607-5610 (1998).
- Morin, G. B.
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Nachdrucke und Genehmigungen
