Tröpfchendigital TRAP (ddTRAP): Anpassung des Telomere Repeat Amplification Protocol an die Reaktion auf die digitale Polymerase Chain Reaction
Summary
Wir haben erfolgreich den Standard-Telomere-Wiederholungsverstärkungsprotokoll (TRAP) umgebaut, der in Tröpfchenspolonen-Kettenreaktionen eingesetzt werden soll. Dieser neue Test, genannt ddTRAP, ist sensibler und quantitativer, was eine bessere Erkennung und statistische Analyse der Telomeraseaktivität in verschiedenen menschlichen Zellen ermöglicht.
Abstract
Das Telomere-Wiederholungsverstärkungsprotokoll (TRAP) ist der am weitesten verbreitete Test, um Telomeraseaktivität innerhalb einer bestimmten Probe zu erkennen. Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-basierte Methode ermöglicht robuste Messungen der Enzymaktivität von den meisten Zelllysaten. Der gelbasierte TRAP mit fluoreszierend gekennzeichneten Primern begrenzt den Probendurchsatz, und die Fähigkeit, Unterschiede in Proben zu erkennen, ist auf zwei oder größere Veränderungen in der Enzymaktivität beschränkt. Der Tröpfchendigital TRAP, ddTRAP, ist ein hochsensibler Ansatz, der vom traditionellen TRAP-Test modifiziert wurde und es dem Anwender ermöglicht, eine robuste Analyse von 96 Proben pro Lauf durchzuführen und eine absolute Quantifizierung der DNA zu erhalten (Telomerase Extension Produkte). ) Eingaben in jeder PCR. Der neu entwickelte ddTRAP-Test überwindet daher die Grenzen des traditionellen gelbasierten TRAP-Tests und bietet einen effizienteren, präziseren und quantitativen Ansatz zur Messung der Telomerasaktivität im Labor und in klinischen Umgebungen.
Introduction
Telomere sind dynamische DNA-Proteinkomplexe an den Enden linearer Chromosomen. Menschliche Telomere bestehen aus einem Array von 5 ‘-TTAGGGn hexamerischen Wiederholungen, die bei der Geburt1in der Länge zwischen 12 – 15 Kilobasen (kb) variieren. Das menschliche Telomerase, das Ribonucleoprotein-Enzym, das die Telomere unterhält, wurde erstmals in HeLa-Zell-Lysaten (Krebszelllinie) 2 identifiziert. Telomere und Telomerase spielen zusammen eine große Rolle in einem Spektrum biologischer Prozesse wie Genomschutz, Genregulation und Krebszellunsterblichkeit3,4, 5,6.
Die menschliche Telomerase besteht in erster Linie aus zwei Schlüsselkomponenten, nämlich der Telomerase Reverse Transkriptase und der Telomerase RNA (hTERT bzw. hTERC). Die Proteinuntereinheit hTERT ist die katalytisch aktive Rückkehr-Transkriptase-Komponente des Telomerase-Enzyms. Die RNA-Vorlage, hTERC, stellt Telomerase mit der Vorlage zur Verfügung, um and/oder die Telomere zu erweitern oder zu pflegen. Die meisten menschlichen somatischen Gewebe haben keine nachweisbare Telomerase-Aktivität. Die Unfähigkeit der DNA-Polymerase, das Ende des hinterherhinkenden DNA-Strangs zu verlängern, zusammen mit dem Mangel an Telomerase führt zu einer fortschreitenden Verkürzung der Telomere nach jeder Runde der Zellteilung. Diese Phänomene führen in den meisten somatischen Zellen zu einer telomerierten Verkürzung, bis sie eine kritisch verkürzte Länge erreichen, wobei die Zellen in einen Zustand der replizierenden Seneszenz gelangen. Die maximale Anzahl der Teilung einer Zelle wird durch ihre Telomere-Länge diktiert, und dieser Block zur fortgesetzten Zellteilung wird angenommen, um die Progression zur Onkogenese zu verhindern 7. Krebszellen sind in der Lage, die durch Telom verursachte Replikationsseneszenz zu überwinden und sich weiter zu vermehren, indem sie Telomerase nutzen, um ihre Telomere zu erhalten. Etwa 90% der Krebserkrankungen aktivieren Telomerase, was die Telomerasaktivität sowohl bei der Krebsfrüherkennung als auch bei der Behandlung von entscheidender Bedeutung macht.
Die Entwicklung des TRAP-Test in den 1990er Jahren war maßgeblich an der Identifizierung der notwendigen Komponenten des Telomerase-Enzyms sowie an der Messung von Telomerase in einer Vielzahl von Zellen und Geweben, sowohl normal als auch krebserregend, beteiligt. Der originale gelbasierte PCR-Test verwendete radioaktiv beschriftete DNA-Substrate, um Telomeraseaktivität zu erkennen. Im Jahr 2006 wurde der Test in eine nicht radioaktive Formmitfluoreszierenden Substraten 8,9angepasst. Durch den Einsatz fluoreszierender Substrate konnten die Anwender die Telomerase-Erweiterungsprodukte als Bänder auf einem Gel visualisieren, indem sie es der richtigen Anregungswellenlänge aussetzten. Die Empfindlichkeit des TRAP-Tests und seine Fähigkeit, Telomerase-Aktivität in Rohzell-Lysaten zu erkennen, hat diesen Test zur am weitesten verbreiteten Methode zur Messung der Telomerasaktivität gemacht. Der TRAP-Test hat jedoch Grenzen. Der Test ist gelebasiert, so dass es schwierig ist, die notwendigen Replikate in moderaten bis hochdurchsatz-Studien durchzuführen, und so wird nur selten eine korrekte statistische Analyse durchgeführt. Darüber hinaus ist der gelenbasierte Test aufgrund der Unfähigkeit, weniger als zwei Unterschiede in der Telomerasetaktivität zwischen den Proben zu erkennen, nur schwer zuverlässig zu quantifizieren. Die Überwindung dieser beiden Einschränkungen ist für enzymatische Aktivitätsuntersuchungen wie den TRAP von entscheidender Bedeutung, um in klinische oder industrielle Umgebungen zur Erkennung von Telomeraseaktivität in Patientenproben oder Medikamentendesign-Studien zu gelangen.
Digital PCR wurde 1999 entwickelt, um die exponentielle und analoge Natur von PCR in einen linearen und digitalen Test10umzuwandeln. Tröpfchen Digital PCR (ddPCR) ist die neueste Innovation der ursprünglichen digitalen PCR-Methodik. Tröpfchendigital wurde mit dem Aufkommen von fortschrittlichen Mikrofluidik und Öl-in-Wasser-Emulsion-Chemie entwickelt, um stabile und gleich große Tröpfchen zuverlässig zu erzeugen. Im Gegensatz zu gelbasierter und sogar quantitativer PCR (qPCR) generiert ddPCR eine absolute Quantifizierung des Eingangsmaterials. Der Schlüssel zu ddPCR ist die Generierung von ~ 20.000 individuellen Reaktionen durch die Teilung von Proben in Tröpfchen. Nach dem Endpunkt PCR scannt der Tröpfchenleser jeden Tröpfchenstreuer auf eine Fließzytometer-ähnliche Art und Weise, indem er das Vorhandensein oder Fehlen von Fluoreszenz in jedem einzelnen Tröpfchen zählt, vergrößert und aufzeichnet (d.h. das Fehlen oder das Vorhandensein von PCR-Amplicons in jedem Tröpfchen). Mit Hilfe der Poisson-Verteilung werden die Eingangsmoleküle anhand des Verhältnisses der positiven Tröpfchen zur Gesamtzahl der Tröpfchen geschätzt. Diese Zahl stellt eine Schätzung der Anzahl der Eingangsmoleküle in jeder PCR dar. Darüber hinaus wird ddPCR auf einer 96-well-Platte durchgeführt und analysiert, die es dem Anwender ermöglicht, viele Proben zu führen, sowie biologische und technische Replikate für eine korrekte statistische Analyse durchzuführen. Als Ergebnis haben wir die leistungsstarke Quantifizierung und Moderate-Durchsatz-Natur von ddPCR mit dem TRAP-Test kombiniert, um den ddTRAP-Test 11 zu entwickeln. Dieser Test ist für Anwender gedacht, um die absolute Telomerasaktivität aus biologischen Proben 11,12zu untersuchen und robust zu quantifizieren. Die Empfindlichkeit des ddTRAP ermöglicht die Quantifizierung der Telomerase-Aktivität aus begrenzten und wertvollen Proben, einschließlich Einzeller-Messungen. Darüber hinaus können die Konsumenten auch die Auswirkungen von Telomerase-Manipulationen und/oder Medikamenten mit absoluter Quantifizierung von weniger als zweifachen Änderungen (~ 50% Unterschiede) untersuchen. Der ddTRAP ist die natürliche Entwicklung des TRAP-Sassay in die digitale und überstrahlerische Natur moderner Laborversuche und klinischer Umgebungen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Messung der Telomeraseaktivität ist für eine Vielzahl von Forschungsthemen von entscheidender Bedeutung, darunter Krebs, Telomerbiologie, Alterung, regenerative Medizin und strukturbasiertes Arzneimitteldesign. Telomerase RNPs sind sehr reichlich vorhanden, auch in Krebszellen, was die Erkennung und Untersuchung dieses Enzyms herausfordernd macht. In diesem Beitrag beschrieben wir die schrittweisen Verfahren für den neu entwickelten ddTRAP-Test, um die Telomerase-Aktivität in Zellen robust zu quantifizieren. Durc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten Förderquellen der National Institutes of Health (NIH) (NCI-R00-CA197672-01A1) anerkennen. Kleine Lungenkrebslinien (SHP77 und H82) waren ein großzügiges Geschenk von Dr. John Minna und Adi Gazdar vom UT Southwestern Medical Center.
Materials
| 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Ambion | AM9855G | RNAse/DNAse free |
| 1 M MgCl2 | Ambion | AM9530G | RnAse/DNAse free |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Ambion | AM9261 | RNAse/DNAse free |
| Surfact- Amps NP-40 | Thermo Scientific | 28324 | |
| 100% Ultrapure Glycerol | Invitrogen | 15514011 | RNAse/DNAse free |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Thermo Scientific | 36978 | Powder |
| 2-Mercaptoethanol | SIGMA-ALDRICH | 516732 | |
| Nuclease Free H20 | Ambion | AM9932 | RNAse/DNAse free |
| 2.5 mM dNTP mix | Thermo Scientific | R72501 | 2.5 mM of each dATP, dCTP, dGTP and dTTP |
| 2 M KCl | Ambion | AM9640G | RNAse/DNAse free |
| 100% Tween-20 | Fisher | 9005-64-5 | |
| 0.5 M EGTA pH 8.0 | Fisher | 50-255-956 | RNAse/DNAse free |
| Telomerase Substrate (TS) Primer | Integrated DNA Technology (IDT) | Custom Primer (HPLC Purified) | 5'- AATCCGTCGAGCAGAGTT-3' |
| ACX (Revers) Primer | Integrated DNA Technology (IDT) | Custom Primer (HPLC Purified) | 5'- GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC -3' |
| Thin walled (250 ul) PCR grade tubes | USA Scientific | 1402-2900 | strips, plates, tubes etc. |
| QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | Bio Rad | 1864034 | |
| Twin-Tec 96 Well Plate | Fisher | Eppendorf 951020362 | |
| Piercable foil heat seal | Bio Rad | 1814040 | |
| Droplet generator cartidges (DG8) | Bio Rad | 1863008 | |
| Droplet generator oil | Bio Rad | 1863005 | |
| Droplet generator gasket | Bio Rad | 1863009 | |
| 96-well Thermocycler T100 | Bio Rad | 1861096 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio Rad | 1814000 | |
| QX200 Droplet Reader and Quantasoft Software | Bio Rad | 1864001 and 1864003 | |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio Rad | 1863004 | |
| Nuclease Free Filtered Pipette Tips | Thermo Scientific | 10 ul, 20 ul , 200 ul and 1000 ul |
References
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