Summary

Bakterielle Zellkultur auf der Einzelzellebene im Riesenvesikel

Published: April 30, 2019
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Summary

Wir zeigen die einzellige Kultur von Bakterien in riesigen Vesikeln (GVs). GVs, die Bakterienzellen enthalten, wurden nach der Tröpfchentransfermethode hergestellt und auf einer unterstützten Membran auf einem Glassubstrat zur direkten Beobachtung des Bakterienwachstums immobilisiert. Dieser Ansatz kann auch an andere Zellen angepasst werden.

Abstract

Wir haben eine Methode zur Kultivierung von Bakterienzellen auf einzelzelliger Ebene in Riesigen Vesikeln (GVs) entwickelt. Bakterielle Zellkultur ist wichtig für das Verständnis der Funktion von Bakterienzellen in der natürlichen Umgebung. Aufgrund des technologischen Fortschritts können verschiedene bakterielle Zellfunktionen auf einzelzeller Ebene auf engstem Raum aufgedeckt werden. GVs sind kugelförmige mikrogroße Kompartimente, die aus amphiphilen Lipidmolekülen bestehen und verschiedene Materialien, einschließlich Zellen, aufnehmen können. In dieser Studie wurde eine einzelne Bakterienzelle durch die Tröpfchenübertragungsmethode in 10–30 m GVs eingekapselt und die GVs, die Bakterienzellen enthielten, auf einer unterstützten Membran auf einem Glassubstrat immobilisiert. Unsere Methode ist nützlich, um das Echtzeitwachstum einzelner Bakterien in GVs zu beobachten. Wir kultivierten Escherichia coli (E. coli) Zellen als Modell innerhalb von GVs, aber diese Methode kann an andere Zelltypen angepasst werden. Unsere Methode kann in den Bereichen Mikrobiologie, Biologie, Biotechnologie und Synthetische Biologie eingesetzt werden.

Introduction

Die Kultur der Bakterienzellen auf einzelzeller Ebene hat zunehmend Beachtung gefunden. Die Kultivierung von Bakterienzellen auf einzelzeller Ebene innerhalb eines begrenzten Raumes kann bakterielle Funktionen wie phänotypische Variabilität1,2,3,4, Zellverhalten5, 6 , 7 , 8 , 9und Antibiotikaresistenz10,11. Aufgrund der jüngsten Fortschritte in Kulturtechniken kann die Kultur einzelner Bakterien auf engstem Raum erreicht werden, z. B. in einem Well-Chip4,7,8, Geltröpfchen12,13 , und Wasser-in-Öl (W/O) Tröpfchen5,11. Um das Verständnis oder die Nutzung einzelner Bakterienzellen zu fördern, sind weitere technische Entwicklungen der Kultivierungstechniken erforderlich.

Vesikel, die die biologische Zellmembran imitieren, sind kugelförmige Kompartimente, die aus amphiphilen Molekülen bestehen und verschiedene Materialien aufnehmen können. Vesikel werden nach Größe klassifiziert und umfassen kleine Vesikel (SVs, Durchmesser < 100 nm), große Vesikel (LVs, 1 m). SVs oder LVs werden aufgrund ihrer Affinität zur biologischen Zellmembran14häufig als Arzneimittelträger eingesetzt. GVs wurden auch als Reaktorsystem für den Bau von Protozellen15 oder künstlicheZellen16verwendet. Die Verkapselung biologischer Zellen inGVs wurde 17,18berichtet, und somit zeigen GVs in Kombination mit dem Reaktorsystem Potenzial als Zellkultursystem.

Hier beschreiben wir zusammen mit einem Video von experimentellen Verfahren, wie VVs als neuartige Zellkulturgefäße verwendet werden können19. GVs, die Bakterien enthalten, wurden nach der Tröpfchentransfermethode20 hergestellt und dann auf einer unterstützten Membran auf einem Deckglas immobilisiert. Wir nutzten dieses System, um das Bakterienwachstum auf einzelzelliger Ebene in GVs in Echtzeit zu beobachten.

Protocol

1. Herstellung von GVs, die Bakterienzellen enthalten, nach der Tröpfchenübertragungsmethode Bereiten Sie Lipid-Lagerlösungen von 1-Palmitoyl-2-Oleoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin (POPC, 10 mM, 1 ml) und 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[Biotinyl(Polyethylenglycol)-2000] (Biotin-PEG-DSPE, 0,1 mM, 1 ml) in Chloroform/ Methanollösung (2/1, v/v) und lagern Sie den Lagerbestand bei -20 °C. Herstellung einer lipidhaltigen Öllösung Gießen Sie 20 l der POPC-L?…

Representative Results

Wir stellen eine einfache Methode zur Generierung von GVs vor, die einzelne Bakterienzellen mit der Tröpfchenübertragungsmethode enthalten (Abbildung 1). Abbildung 1a zeigt ein schematisches Bild der Ausfällung von GVs, die Bakterien enthalten. W/O-Tröpfchen, die Bakterien enthalten, werden durch Zentrifugation über die Öl-Wasser-Schnittstelle (Lipid-Monolayer) zu GVs übertragen. Der Dichteunterschied zwischen Saccharose (…

Discussion

Hier beschreiben wir eine Methode zur Kultivierung von Bakterienzellen auf einzelzeller Ebene innerhalb von GVs. Bei dieser einfachen Methode werden GVs gebildet, die Bakterienzellen auf einzelzeller Ebene enthalten, indem die Tröpfchenübertragungsmethode verwendet wird. Im Vergleich zu anderen Ansätzen zur Gewinnung von GVs, die Bakterienzellen enthalten, hat diese Methode zwei Vorteile: (i) es ist leicht zu entwickeln, und (ii) ein kleines Volumen (2 l) der Probenlösung ist erforderlich, um die GVs vorzubereiten. D…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von einer Leading Initiative for Excellent Young Researchers (LEADER, No. 16812285) des Ministeriums für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie (MEXT) japans unterstützt, einem Stipendium für junge Wissenschaftlerforschung (Nr. 18K18157, 16K21034) von der Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) bis M.M., und Grant-in-Aid von MEXT bis K.K. (Nr. 17H06417, 17H06413).

Materials

Bactotryptone BD Biosciences 211705
Chloroform Wako Pure Chemicals 032-21921
Cover glass (18 × 18 mm) Matsunami Glass Ind. C018181 thickness 0.13–0.17 mm
Cover glass (30 × 40 mm) Matsunami Glass Ind. custom-order thickness 0.25–0.35 mm
Desktop centrifuge Hi-Tech Co. ATT101 swing rotor type
Double-faced seal (10 × 10 × 1 mm) Nitoms T4613
Glass vial AS ONE 6-306-01 Durham fermentation tube
Glucose Wako Pure Chemicals 049-31165
Inverted microscope Olympus IX-73
Methanol Wako Pure Chemicals 133-16771
Microscopic heating stage system TOKAI HIT TP-110R-100
Mineral oil Nacalai Tesque 23334-85
Mini-extruder Avanti Polar Lipids 610000
Neutravidin Thermo Fisher Scientific 31000
Objective lens Olympus LUCPLFLN 40×/0.6 NA
Polycarbonate membranes Avanti Polar Lipids 610005 pore size 100 nm
sCMOS camera Andor Zyla 4.2 plus
Sodium chloride Wako Pure Chemicals 191-01665
Sucrose Wako Pure Chemicals 196-00015
Ultrasonic bath AS ONE ASU-3D
Yeast extract BD Biosciences 212750
0.6 mL lidded plastic tube Watson 130-806C
1.5 mL lidded plastic tube Sumitomo Bakelite Co. MS4265-M
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocoline Avanti Polar Lipids 850457P POPC
1,2-distearoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000] Avanti Polar Lipids 880129P Biotin-PEG-DSPE

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Cite This Article
Morita, M., Ota, Y., Katoh, K., Noda, N. Bacterial Cell Culture at the Single-cell Level Inside Giant Vesicles. J. Vis. Exp. (146), e59555, doi:10.3791/59555 (2019).

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