Coltura di cellule batteriche a livello di singola cellula all'interno di vescicoli giganti

Summary

Dimostriamo la coltura unicellulare di batteri all'interno di vescicoli giganti (GV). I GV contenenti cellule batteriche sono stati preparati con il metodo di trasferimento delle goccioline e sono stati immobilizzati su una membrana sostenuta su un substrato di vetro per l'osservazione diretta della crescita batterica. Questo approccio può anche essere adattabile ad altre cellule.

Abstract

Abbiamo sviluppato un metodo per coltivare cellule batteriche a livello di singola cellula all'interno di vescicole giganti (GV). La coltura delle cellule batteriche è importante per comprendere la funzione delle cellule batteriche nell'ambiente naturale. A causa dei progressi tecnologici, varie funzioni delle cellule batteriche possono essere rivelate a livello di singola cellula all'interno di uno spazio confinato. I GV sono compartimenti sferici di micro-dimensioni composti da molecole lipidiche anfifili e possono contenere vari materiali, comprese le cellule. In questo studio, una singola cellula batterica è stata incapsulata in 10-30 GV con il metodo di trasferimento delle goccioline e i Env contenenti cellule batteriche sono stati immobilizzati su una membrana supportata su un substrato di vetro. Il nostro metodo è utile per osservare la crescita in tempo reale di singoli batteri all'interno dei GV. Abbiamo coltivato cellule di Escherichia coli (E. coli) come modello all'interno di GV, ma questo metodo può essere adattato ad altri tipi di cellule. Il nostro metodo può essere utilizzato nei campi scientifici e industriali della microbiologia, della biologia, della biotecnologia e della biologia sintetica.

Introduction

La coltura delle cellule batteriche a livello di singola cellula ha ricevuto una crescente attenzione. Coltivare cellule batteriche a livello di singola cellula all'interno di uno spazio ristretto può chiarire le funzioni batteriche come la variabilità fenotipica^1,2,3,4, il comportamento cellulare^{5, 6} È possibile: ^{, 7} (in questo stato ^{, 8} (IN vio ^{, 9}, e resistenza agli antibiotici....

Protocol

1. Preparazione di GV contenenti cellule batteriche con il metodo di trasferimento goccia

1. Preparare soluzioni di riserva lipididiche di 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC, 10 mM, 1 mL) e 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleglycol)-2000] (biotin-PEG-DSPE, 0,1 mM, 1 mL) in cloroformio/ soluzione di metanolo (2/1, v/v) e conservare il brodo a -20 gradi centigradi.
2. Preparazione di una soluzione di olio contenente lipidi
   1. Versare in un tubo di vetro 20 - L della soluzione POPC e 4 -L della soluzione biotina-PEG-DSPE (Figura1b (i)).
   2. Ev....

Results

Presentiamo un metodo semplice per generare GV contenenti singole cellule batteriche utilizzando il metodo di trasferimento delle gocciole (Figura 1). La figura 1a mostra un'immagine schematica della precipitazione di GV contenenti batteri. Le goccioline W/O contenenti batteri vengono trasferite attraverso l'interfaccia olio-acqua (strato di lipidi) dalla centrifugazione per formare i GV. La differenza di densità tra il saccarosi.......

Discussion

Qui, descriviamo un metodo per coltivare le cellule batteriche a livello di singola cellula all'interno dei GV. Questo semplice metodo prevede la formazione di GV contenenti cellule batteriche a livello di singola cellula utilizzando il metodo di trasferimento delle gocciole. Rispetto ad altri approcci per ottenere GV contenenti cellule batteriche, questo metodo presenta due vantaggi: (i) è facile da sviluppare e (ii) è necessario un piccolo volume (2 -L) della soluzione campione per preparare i GV. Il metodo di trasferi.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bactotryptone	BD Biosciences	211705
Cloroformio	Wako Pure Chemicals	032-21921
Vetro di copertura (18 &volte; 18 mm)	Matsunami Vetro Ind.	C018181	spessore 0,13– 0,17 mm
Vetro di copertura (30 & 40 mm)	Vetro Matsunami Ind.	Spessore dell'ordine personalizzato	0,25 ... Centrifuga da tavolo da 0,35 mm
	Hi-Tech Co.	ATT101	tipo di rotore oscillante
Guarnizione bifacciale (10 & volte; 10 &volte; 1 mm)	Nitoms	T4613
Fiala di vetro	AS ONE	6-306-01	Tubo di fermentazione Durham
Glucosio	Wako Pure Chemicals	049-31165
Microscopio invertito	Olympus	IX-73
Metanolo	Wako Pure Chemicals	133-16771
Sistema di riscaldamento microscopico	TOKAI HIT	TP-110R-100
Olio minerale	Nacalai Tesque	23334-85
Mini-estrusore	Avanti Polar Lipids	610000
Neutravidin	Thermo Fisher Scientific	31000
Obiettivo	Olympus	LUCPLFLN 40×/0.6 NA
Membrane in policarbonato	Avanti Polar Lipids	610005	dimensione dei pori 100 nm
telecamera sCMOS	Andor	Zyla 4.2 plus
cloruro di sodio	Wako Pure Chemicals	191-01665
Saccarosio	Wako Pure Chemicals	196-00015
Bagno ad ultrasuoni	AS ONE	ASU-3D
Estratto di lievito	BD Biosciences	212750
Provetta in plastica con coperchio da 0,6 mL	Watson	130-806C
Provetta in plastica con coperchio da 1,5 mL	Sumitomo Bakelite Co.	MS4265-M
1-palmitoil-2-oleoyl-sn-glicero-3-fosfocolina	Avanti Polar Lipids	850457P	POPC
1,2-distearoil-snglycero-3-fosfoethanolamine-N-[biotinil(polietilenglicole)-2000]	Avanti Polar Lipids	880129P	Biotin-PEG-DSPE