Bakteriell cellkultur på Single-cell nivå inuti Giant vesicles
Summary
Vi demonstrerar encellig kultur av bakterier inuti jätte blåsor (GVs). GVs som innehåller bakterieceller bereddes av DROPP överföringsmetoden och immobiliserades på ett membran som stöds på ett glas substrat för direkt observation av bakterietillväxt. Den här metoden kan också vara anpassningsbar till andra celler.
Abstract
Vi utvecklade en metod för odling av bakterieceller på encellig nivå inuti Giant blåsor (GVS). Bakteriell cellkultur är viktigt för att förstå funktionen hos bakterieceller i den naturliga miljön. På grund av tekniska framsteg, olika bakteriella cellfunktioner kan avslöjas på encellig nivå inuti ett trångt utrymme. GVS är sfäriska mikro-stora fack består av amfifila lipid molekyler och kan hålla olika material, inklusive celler. I denna studie var en enda bakteriecell inkapslad i 10 – 30 μm GVs av DROPP metoden och GVs som innehöll bakterieceller immobiliserades på ett membran som stöds på ett glas substrat. Vår metod är användbar för att observera realtids-tillväxten av enstaka bakterier inuti GVs. Vi odlade Escherichia coli (E. coli) celler som en modell inuti GVS, men denna metod kan anpassas till andra celltyper. Vår metod kan användas inom vetenskap och industriella områden inom mikrobiologi, biologi, bioteknik och syntetisk biologi.
Introduction
Kulturen i bakterieceller på encellig nivå har fått ökad uppmärksamhet. Odling av bakterieceller på encellig nivå inuti ett trångt utrymme kan belysa bakteriella funktioner såsom fenotypisk variabilitet1,2,3,4, cell Behavior5, 6 , 7 , 8 , 9, och antibiotikaresistens10,11. På grund av de senaste framstegen inom kultur teknik, kan kulturen av enstaka bakterier uppnås i ett trångt utrymme, såsom i en väl chip4,7,8, gel dropp12,13 , och vatten-i-olja (W/O) DROPP5,11. För att främja förståelsen eller utnyttjandet av enstaka bakterieceller behövs ytterligare teknisk utveckling av odlingstekniker.
Vesikler som imiterar det biologiska cellmembranet är sfäriska fack som består av amfifila molekyler och kan hålla olika material. Vesiklarna klassificeras efter storlek och omfattar små blåsor (SVs, diameter < 100 nm), stora vesikler (LVs, 1 μm). SVs eller LVs används ofta som drog bärare på grund av deras affinitet till det biologiska cellmembranet14. GVs har också använts som ett reaktorsystem för byggande av protoceller15 eller konstgjorda-celler16. Inkapsling av biologiska celler i GVS har rapporterats17,18, och därmed GVS Visa potential som ett cellkultursystem i kombination med reaktor systemet.
Här, tillsammans med en video av experimentella procedurer, beskriver vi hur GVs kan användas som nya cell-kultur fartyg19. GVs innehållande bakterier gjordes av DROPP överföringsmetoden20 och immobiliserades sedan på ett membran som stöds på ett täckglas. Vi använde detta system för att observera bakterietillväxt på Single-cellnivå inuti GVs i realtid.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här beskriver vi en metod för odling av bakterieceller på encellsnivå inuti GVs. Denna enkla metod innebär att bilda GVS som innehåller bakterieceller på Single-cellnivå med hjälp av DROPP överföringsmetod. Jämfört med andra metoder för att erhålla GVs som innehåller bakterieceller, har denna metod två fördelar: (i) det är lätt att utveckla, och (II) en liten volym (2 μL) av provlösningen krävs för att förbereda GVs. DROPP överföringsmetoden20 för beredning av GVS som i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av ett ledande initiativ för framstående unga forskare (LEADER, nr 16812285) från ministeriet för utbildning, kultur, sport, vetenskap och teknik (MEXT) i Japan, ett bidrag-in-Aid för ung forskare forskning (nr 18K18157, 16K21034) från Japan Society for främjande av vetenskap (JSPS) till M.M., och Grant-in-Aid från MEXT till KK (nr 17H06417, 17H06413).
Materials
| Bactotryptone | BD Biosciences | 211705 | |
| Chloroform | Wako Pure Chemicals | 032-21921 | |
| Cover glass (18 × 18 mm) | Matsunami Glass Ind. | C018181 | thickness 0.13–0.17 mm |
| Cover glass (30 × 40 mm) | Matsunami Glass Ind. | custom-order | thickness 0.25–0.35 mm |
| Desktop centrifuge | Hi-Tech Co. | ATT101 | swing rotor type |
| Double-faced seal (10 × 10 × 1 mm) | Nitoms | T4613 | |
| Glass vial | AS ONE | 6-306-01 | Durham fermentation tube |
| Glucose | Wako Pure Chemicals | 049-31165 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX-73 | |
| Methanol | Wako Pure Chemicals | 133-16771 | |
| Microscopic heating stage system | TOKAI HIT | TP-110R-100 | |
| Mineral oil | Nacalai Tesque | 23334-85 | |
| Mini-extruder | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
| Neutravidin | Thermo Fisher Scientific | 31000 | |
| Objective lens | Olympus | LUCPLFLN 40×/0.6 NA | |
| Polycarbonate membranes | Avanti Polar Lipids | 610005 | pore size 100 nm |
| sCMOS camera | Andor | Zyla 4.2 plus | |
| Sodium chloride | Wako Pure Chemicals | 191-01665 | |
| Sucrose | Wako Pure Chemicals | 196-00015 | |
| Ultrasonic bath | AS ONE | ASU-3D | |
| Yeast extract | BD Biosciences | 212750 | |
| 0.6 mL lidded plastic tube | Watson | 130-806C | |
| 1.5 mL lidded plastic tube | Sumitomo Bakelite Co. | MS4265-M | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocoline | Avanti Polar Lipids | 850457P | POPC |
| 1,2-distearoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000] | Avanti Polar Lipids | 880129P | Biotin-PEG-DSPE |
References
- Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. Regulation of noise in the expression of a single gene. Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).
- Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. Gene regulation at the single-cell level. Science. 307, 1962-1965 (2005).
- Eldar, A., Elowitz, M. B. Functional roles for noise in genetic circuits. Nature. 467, 167-173 (2010).
- Hashimoto, M., et al. Noise-driven growth rate gain in clonal cellular populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3251-3256 (2016).
- Boedicker, J. Q., Vincent, M. E., Ismagilov, R. F. Microfluidic confinement of single cells of bacteria in small volumes initiates high-density behavior of quorum sensing and growth and reveals its variability. Angewandte Chemie International Edition. 48, 5908-5911 (2009).
- Christopher, M., Waters, B. L. B. Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 21, 319-346 (2005).
- Inoue, I., Wakamoto, Y., Moriguchi, H., Okano, K., Yasuda, K. On-chip culture system for observation of isolated individual cells. Lab on a Chip. 1, 50-55 (2001).
- Wang, P., et al. Robust growth of Escherichia coli. Current Biology. 20, 1099-1103 (2010).
- Reshes, G., Vanounou, S., Fishov, I., Feingold, M. Cell shape dynamics in Escherichia coli. Biophysical Journal. 94, 251-264 (2008).
- Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. Bacterial Persistence as a Phenotypic Switch. Science. 305, 1622-1625 (2004).
- Brouzes, E., et al. Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (34), 14195-14200 (2009).
- Zengler, K., et al. Cultivating the uncultured. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (24), 15681-15686 (2002).
- Eun, Y., Utada, A. S., Copeland, M. F., Takeuchi, S., Weibel, D. B. Encapsulating bacteria in agarose microparticles using microfluidics for high-throughput cell analysis and isolation. ACS Chemical Biology. 6, 260-266 (2011).
- Allen, T. M., Cullis, P. R. Liposomal drug delivery systems: From concept to clinical applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 65, 36-48 (2013).
- Szostak, J. W., Bartel, D. P., Luisi, P. L. Synthesizing life. Nature. 409, 387-390 (2001).
- Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (51), 17669-17674 (2004).
- Tan, Y. C., Hettiarachchi, K., Siu, M., Pan, Y. R., Lee, A. P. Controlled microfluidic encapsulation of cells, proteins, and microbeads in lipid vesicles. Journal of the American Chemical Society. 128 (17), 5656-5658 (2006).
- Chowdhuri, S., Cole, C. M., Devaraj, N. K. Encapsulation of Living Cells within Giant Phospholipid Liposomes Formed by the Inverse-Emulsion Technique. ChemBioChem. 17, 886-889 (2016).
- Morita, M., Katoh, K., Noda, N. Direct observation of bacterial growth in giant unilamellar vesicles: a novel tool for bacterial cultures. ChemistryOpen. 7, 845-849 (2018).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of Unilamellar Vesicles Using an Inverted Emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
- Hope, M. J., Bally, M. B., Webb, G., Cullis, P. R. Production of large unilamellar vesicles by a rapid extrusion procedure. Characterization of size distribution, trapped volume and ability to maintain a membrane potential. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 812, 55-65 (1985).
- Tsumoto, K., Matsuo, H., Tomita, M., Yoshimura, T. Efficient formation of giant liposomes through the gentle hydration of phosphatidylcholine films doped with sugar. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 68, 98-105 (2009).
- Li, A., Pazzi, J., Xu, M., Subramaniam, A. B. Cellulose abetted assembly and temporally decoupled loading of cargo into vesicles synthesized from functionally diverse lamellar phase forming amphiphiles. Biomacromolecules. 19, 849-859 (2018).
- Weinberger, A., et al. Gel-assisted formation of giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 105, 154-164 (2013).
- Kurokawa, C., et al. DNA cytoskeleton for stabilizing artificial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (28), 7228-7233 (2017).
- Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane. Angewandte Chemie International Edition. 51, 3114-3118 (2012).
- Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Levy, D. Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (18), 7276-7281 (2013).
- Trantidou, T., Dekker, L., Polizzi, K., Ces, O., Elani, Y. Functionalizing cell-mimetic giant vesicles with encapsulated bacterial biosensors. Interface Focus. 8, 20180024 (2018).
- Elani, Y., et al. Constructing vesicle-based artificial cells with embedded living cells as organelle-like modules. Scientific Reports. 8, 4564 (2018).
