Hier presenteren we een protocol, ontworpen om gebruik te maken van chemogenetische hulpmiddelen om de activiteit van corticale Interneuron voorlopercellen getransplanteerd in de cortex van vroege postnatale muizen te manipuleren.
Neuronale ontwikkeling wordt gereguleerd door een complexe combinatie van omgevings-en genetische factoren. Beoordeling van de relatieve bijdrage van elk onderdeel is een gecompliceerde taak, die bijzonder moeilijk is met betrekking tot de ontwikkeling van γ-aminoboterzuur (GABA) erge corticale interneuronen (CIs). CIs zijn de belangrijkste remmende neuronen in de hersenschors, en ze spelen belangrijke rollen in neuronale netwerken, door het reguleren van zowel de activiteit van individuele piramidale neuronen, evenals de oscillatoire gedrag van neuronale ensembles. Ze worden gegenereerd in voorbijgaande embryonale structuren (mediale en caudale ganglionische eminences-MGE en CGE) die zeer moeilijk zijn om efficiënt te targeten met behulp van utero-elektroporatie benaderingen. Interneuron voorlopercellen migreren lange afstanden bij normale embryonale ontwikkeling, voordat ze in het corticale circuit integreren. Dit opmerkelijke vermogen om te dispergeren en te integreren in een ontwikkelend netwerk kan worden gekaapt door het transplanteren van embryonale Interneuron precursoren in vroege postnatale gastheer cortices. Hier presenteren we een protocol dat genetische modificatie van embryonale Interneuron voorlopercellen mogelijk maakt met focale ex vivo elektroporation. Deze engineered Interneuron precursoren worden vervolgens getransplanteerd in vroege postnatale gastheer cortices, waar ze zullen rijpen in gemakkelijk identificeerbare CIs. Dit protocol maakt het gebruik van meerdere genetisch gecodeerde hulpmiddelen mogelijk, of de mogelijkheid om de expressie van specifieke genen in Interneuron voorlopercellen te reguleren, om de impact van genetische of omgevingsvariabelen op de rijping te onderzoeken en integratie van CIs.
De functie van neuronale netwerken berust op het bestaan van een evenwichtige aanvulling van excitatory projectie neuronen en remmende interneuronen. Hoewel corticale interneuronen (CIS) slechts 20% van alle neuronen in de zoogdier cortices vertegenwoordigen, worden tekorten in hun aantal of functie verondersteld een belangrijke rol te spelen in de pathogenese van neuroontwikkelingsstoornissen1,2. De studie van CI-ontwikkeling is een uitdaging omdat CIs worden gegenereerd in voorbijgaande embryonale structuren die moeilijk toegankelijk zijn, en ze volgen een lange tangentiële migratie voordat ze het pallium bereiken en hun volwassen anatomische en fysiologische eigenschappen3. Zowel genetische als milieu mechanismen zijn gekend die CI-ontwikkeling4reguleren, maar het is moeilijk gebleken om de relatieve bijdrage van meerdere factoren te bestuderen.
Veel inzichten in CI-ontwikkeling werden verkregen met behulp van in vitro kweeksystemen na isolatie van voorlopercellen uit de ganglionische eminenties5,6. Een van de grote voordelen van deze methoden is het potentieel om de geïsoleerde voor ouders te labelen en genetisch te modificeren en hun differentiatie in detail te volgen, om celautonome veranderingen te detecteren. Echter, deze methoden zijn niet in staat om informatie te bieden over de interacties tussen het ontwikkelen van interneuronen en een actief netwerk. We hebben deze protocollen aangepast door transplantatie van de gemodificeerde precursoren in de vroege postnatale cortex. Interneuron voorlopercellen geïsoleerd van embryonale ganglionische eminenties kunnen overleven, dispergeren en integreren in het hostnetwerk bij transplantatie in de cortex7,8. Deze methode is gebruikt om de ernst van epileptische aanvallen in genetische Muismodellen te verminderen, en is voorgesteld als een mogelijke nieuwe therapie voor verschillende neuroontwikkelingsstoornissen9,10. Een eerder protocol beschrijft een procedure om deze precursoren te transfusie met virale vectoren voorafgaand aan transplantaties11. Het protocol dat we hier beschrijven, maakt ook de genetische modificatie van interneuronen mogelijk, maar vereist niet de creatie van een virale vector, die alleen een plasmide DNA nodig heeft, wat de flexibiliteit aanzienlijk vergroot. Sommige studies rapporteerden succes bij het gebruik in utero elektroporation voor het genetisch wijzigen van Interneuron voorlopercellen in de caudal ganglionaire eminences (CGE)12, maar deze methode heeft zeer moeilijk te reproduceren bewezen.
In de sectie representatieve resultaten illustreren we het gebruik van deze methode om Designer receptoren te uiten die uitsluitend worden geactiveerd door designer drugs (DREADDs13) in de getransplanteerde CIS, een methode die we gebruikten in een recente publicatie14. We uitgedrukt hM3D (GQ), een Engineered receptor op basis van de menselijke cholinerge receptor CHRM3, die geen invloed op de neuronale functie tenzij het bindt zijn specifieke ligand Clozapine-N-oxide (CNO). CNO Administration activeert selectief activering van hM3D (GQ) uitdrukken van cellen. We gebruikten deze methode om te laten zien dat cel autonome en voorbijgaande depolarisatie voldoende is om te voorkomen dat apoptosis van CIs tijdens de ontwikkeling14. In combinatie met verschillende genetisch gecodeerde gereedschappen, dit protocol heeft het potentieel om up-of down-reguleren van genexpressie, en visualiseren of manipuleren celactiviteit tijdens verschillende stadia van Interneuron differentiatie.
Hier beschrijven we een breed toegankelijke methodologie voor het genetisch wijzigen van de activiteit van CI-precursoren om de impact van intrinsieke activiteit op de CI-rijping te bestuderen, en/of het effect van gemoduleerde CIs op de assemblage/functie van de geïntegreerde corticale Circuits.
In het verleden hadden verschillende laboratoria, waaronder de onze, in utero-elektroporation experimenten gepresteerd om de projectie neuronen genetisch te wijzigen.6. Echter, in utero electroporatie in ganglionaire eminenties die CI-voorlopercellen omvatten is zeer moeilijk, als gevolg van elektrische geleiding pad problemen. Om dit probleem op te lossen, een klein aantal Labs uitvoeren echografie geleide injecties gevolgd door elektroporation, dat is een veeleisende techniek die dure apparatuur vereist. Dit protocol biedt een alternatief voor deze methodologieën die voor de meerderheid van de wetenschappelijke gemeenschap toegankelijk zijn.
Een van de meest uitdagende aspecten van dit protocol is het maximaliseren van het aantal cellen dat overleven in de host cortex tot volwassen stadia, wanneer fenotypische analyse wordt meestal uitgevoerd (zeer afhankelijk van het experiment ontwerp, maar meestal ouder dan P17). Er zijn drie belangrijke stappen die de onderzoeker moet letten: (1) de efficiëntie van de elektroporation. Dit kan gemaximaliseerd worden door de zuiverheid van DNA plasmiden te waarborgen. Voor deze procedure moeten alleen hoogwaardige DNA-plasmiden (een A260/a280 ratio van 1,9-2,0) worden gebruikt. We verkrijgen dergelijke hoogwaardige DNA-preparaten door het gebruik van cesium chloride-DNA-zuivering. Een andere cruciale factor is de promotor die de uitdrukking van het belang van het gen stimuleert. We ontdekten dat de pCAGGs vector, die bestaat uit de Chicken b-actin Promoter, extreem krachtig is en de elektroporation efficiency drastisch kan verhogen. 2. het aantal beginnende donor embryo’s. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat een groot aantal (12-16) embryo’s van dezelfde fase worden geëvacueerd. Dit aantal kan worden verhoogd als meer experimenteurs embryo dissecties uitvoeren en samen snijden, omdat het belangrijk is dat embryonale corticale schijfjes zo snel mogelijk worden verkregen, geëvacueerd en naar de incubator worden overgebracht. (3) het is belangrijk om ervoor te zorgen dat een groot aantal cellen in elk pup wordt geïnjecteerd om een hoge kans op getransplanteerde celoverleving tot volwassen stadia te garanderen. Bovendien zal dit de kans op succesvolle transplantaties drastisch verbeteren, omdat celpreparaten met lage dichtheid resulteren in ongelijke menging van de cellen met het medium, wat significante variabiliteit zal opleveren in de getransplanteerde hersenen15 .
Het hier beschreven protocol was op maat gemaakt voor het onderzoeken van de rol van activiteit bij het reguleren van CI-overleving op een cel-autonome manier. De P14-P17 tijdvenster voor het uitvoeren van de CNO injecties werd specifiek gekozen volgens gepubliceerde gegevens, waaruit blijkt dat de piek van getransplanteerde CI progenitors celdood optreedt tijdens deze periode16. Daarom is dit tijdsbestek of de frequentie van CNO-injecties mogelijk niet van toepassing op andere celtypen of hersengebieden, en moet de onderzoeker deze parameters aanpassen volgens de specifieke experimentele doeleinden. Tot slot, de hier beschreven methodologie voor de intracraniële injecties van CIs is alleen haalbaar voor P0-P5 pups (afhankelijk van de achtergrond van de muis lijn). In principe, elke injecties over P5 zal vereisen dunner of verwijderen van de schedel15.
Een van de belangrijkste voordelen van dit protocol is de mogelijkheid om nieuwe genetisch gecodeerde hulpmiddelen te gebruiken om de activiteit van CIs te visualiseren of te manipuleren tijdens verschillende fasen van differentiatie terwijl ze integreren in een ontwikkelend netwerk. Met het tempo van de ontdekking van nieuwe genetisch gecodeerde voltage-en calcium sensoren, evenals nieuwe chemogenetische en optogenetische hulpmiddelen, stelt dit protocol onderzoekers in staat om ze binnen enkele weken na de introductie in plasmide repositories te gebruiken, zoals Addgene.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door een ERC starter Grant (282047), een Wellcome Trust Investigator Award (095589/Z/11/Z), een KP7 EC DESIRE Grant en een Lister Institute Prize aan JB. Het werk in V.P. laboratorium wordt ondersteund door de BBSRC (BB/L022974/1), de Britse Medical Research Council (MRC) en het Francis Crick Institute (dat financiering ontvangt van het MRC, Cancer Research UK en het Wellcome Trust). Het onderzoek in M.D. lab werd mogelijk gemaakt door de subsidie van de Stavros Niarchos Foundation aan de B.S.R.C. “Alexander Fleming”, als onderdeel van het initiatief van de Stichting ter ondersteuning van het Griekse onderzoek.
Medium/Supplements | |||
B-27 | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 175040-044 | |
DMEM/F12 | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 21331-020 | |
DNAse | SIGMA | DN15-100MG | |
FBS | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 10270-098 | |
100x Glutamine | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 35050-061 | |
L15 | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 11415-049 | |
MEM alpha, GlutaMAX | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 32561-029 | |
Neurobasal medium | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 21103-049 | Neuron basic medium |
100x P/S | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 15140-122 | |
Equipment | |||
Electroporator | BTX | ECM 830 generator | |
Injector for acute slice electroporation | Eppendorf | FemtoJet Microinjector | |
Injector for cell transplantation (I) | Visual Sonics | Vevo Injector System | |
Injector for cell transplantation (II) | WPI | NANOLITER2010 | |
Magnetic Stand | WPI | M10L Magnetic Stand | |
Kite Manual Micromanipulator | WPI | KITE-M3-R | |
Platinum Elecrode (I) | Protech International Inc. | CUY-700-1 | |
Platinum Elecrode (II) | Protech International Inc. | CUY-700-2 | |
Steel Base Plate | WPI | 5479 | |
Vibratome | Leica | VT1200S | |
Other Material | |||
Glass capillaries for electroporation | VWR | 1B100-4 | |
Glass capillaries for cell transplantation | Visual Sonics | provided by Visual Sonics | |
Nuclepore 8 µm whatman membrane | SLS | 110414 | |
Organ tissue culture dishes | BD Biosciences (Falcon) | 353037 |