Détermination de la densité de duct biliaire dans le foie de souris
Summary
Nous présentons une méthode assez simple et sensible pour la quantification précise de la densité de conduit biliaire dans le foie de souris. Cette méthode peut aider à déterminer les effets des modificateurs génétiques et environnementaux et l’efficacité des thérapies potentielles dans les modèles murins des maladies biliaires.
Abstract
La souris est largement utilisée comme organisme modèle pour étudier les maladies biliaires. Pour évaluer le développement et la fonction du système biliaire, diverses techniques sont utilisées, y compris la chimie du sérum, l’analyse histologique et l’immunostaining pour des marqueurs spécifiques. Bien que ces techniques puissent fournir des informations importantes sur le système biliaire, elles ne présentent souvent pas une image complète des défauts développementaux du canal biliaire (BD) sur l’ensemble du foie. Cela est dû en partie à la capacité robuste du foie de souris à drainer la bile, même chez les animaux ayant une déficience significative dans le développement biliaire. Ici, nous présentons une méthode simple pour calculer le nombre moyen de BD associés à chaque veine de portail (PV) dans les sections couvrant tous les lobes des souris mutantes/transgéniques. Dans cette méthode, les foies sont montés et sectionnés d’une manière stéréotypée pour faciliter la comparaison entre divers génotypes et conditions expérimentales. Les BD sont identifiés par microscopie légère des cholangiocytes teintés de cytokératine, puis comptés et divisés par le nombre total de PV présents dans la section de foie. À titre d’exemple, nous montrons comment cette méthode peut clairement distinguer entre les souris de type sauvage et un modèle de souris du syndrome d’Alagille. La méthode présentée ici ne peut se substituer aux techniques qui visualisent la structure tridimensionnelle de l’arbre biliaire. Cependant, il offre un moyen facile et direct d’évaluer quantitativement le développement de la BD et le degré de formation de réaction ductulaire chez la souris.
Introduction
L’arbre biliaire est une partie critique du foie des mammifères, permettant le passage de la bile des hépatocytes dans l’intestin. Les canaux biliaires intrahépatiques (BD) sont formés par des cholangiocytes, qui se différencient des hépatoblastes bipotentiels par Notch et TGFMD signalant1,2. La spécification et l’engagement appropriés des cholangiocytes et de leur assemblage dans les BD mûrs sont essentiels pour le développement de l’arbre biliaire intrahépatique. Comme le foie se développe pendant le développement ou lors de la régénération des organes, le système biliaire doit se développer le long du foie pour assurer un drainage biliaire approprié. En outre, un certain nombre de maladies syndromicmiques et non-syndromamiques ont comme conséquence le manque de BDs intrahépatiques3. En outre, un certain nombre de maladies hépatiques aigues et chroniques donnent lieu à des réactions dites canalulaires dans le foie, qui sont définies comme la présence d’un nombre important de cellules qui expriment des marqueurs biliaires, mais ne proviennent pas nécessairement de cellules biliaires ou de la forme brevet BDs4. Dans le désordre multisystème syndrome d’Alagille (ALGS), haploinsufficiency de la ligand de Notch degged1 (JAG1) a comme conséquence la formation pauvre de BD et la cholestasis5,6. Notre laboratoire a récemment démontré qu’une ligne de souris Heterozygous Jag1 déjà générée7 est un modèle animal de paucité BD dans ALGS8. Dans ce modèle de souris d’ALGS, les cholangiocytes sont toujours présents. Cependant, ils ne s’engagent pas à l’incorporation dans les BD de brevet mûrs8. Par conséquent, l’analyse du foie dans un modèle de manque de BD exige plus que la présence apparente ou l’absence des cholangiocytes. Il est important d’évaluer avec précision la mesure dans laquelle les BD matures sont présents dans le foie.
Dans la pathologie anatomique, il existe des méthodes quantitatives acceptées pour évaluer si le manque de BD existe9. Par exemple, les études sur l’ALGS chez les patients humains quantifient souvent le rapport BD à veine portail (PV) en analysant au moins 10 vaisseaux portailpar biopsie du foie9,10. L’analyse de la forme et de la présence globale ou de l’absence de BD de brevet, combinée avec la chimie de sérum, peut fournir l’information valable au sujet du développement de BD chez les souris11,12,13. Cependant, les souris peuvent perdre un nombre significatif de BD avec seulement une augmentation modeste du niveaudebilirubine de sérum 8. En conséquence, une méthode quantitative qui évalue le nombre de BD présents par PV peut fournir une mesure plus directe du degré de manque de BD chez les souris. Dans un rapport récent, nous avons quantifié le nombre de BD par PV sur tous les lobes dufoie et signalé une diminution significative du rapport BD/PV chez les animaux Jag1MD/8 . Au cours de notre analyse, nous avons remarqué que, malgré la variation significative du degré de réponse inflammatoire et des réactions ductulaires, le rapport BD/PV ne montre pas beaucoup de variabilité8. De plus, la quantification du ratio BD/PV nous a permis de démontrer que la suppression d’une copie du gène de glycosyltransferase Poglut1 chez les animaux Jag1MD/MD peut améliorer considérablement leur paucity BD8. Dans un contexte Jag1/ MD, la perte conditionnelle de Poglut1 dans les cellules musculaires lisses vasculaires entraîne une augmentation progressive du nombre de BD, qui est modeste (20-30%) à P7, mais devient important chez les adultes8. Encore une fois, cette technique nous a permis de montrer que même à P7, l’augmentation de la densité de BD chez ces animaux est statistiquement significative. Il convient de noter que l’augmentation de la densité de BD dans ce génotype à l’âge de quatre mois a été validée par l’analyse de fonte de résine aussi bien. 8 Ces observations et d’autres rapports qui ont mesuré la densité de BD dans différents modèles de souris d’ALGS14,15 nous ont incités à incorporer cette méthode dans notre stratégie globale pour analyser des défauts biliaires dans divers mutants et les souris transgéniques.
Ici, nous détaillons une technique simple qui peut être utilisée pour examiner le degré de manque de BD dans les modèles murins de maladie du foie (Figure 1). Dans cette méthode, la co-coloration avec des marqueurs de cholangiocyte cytokatin (CK) 8 et CK19 (ci-après à large spectre CK, wsCK) est employée pour visualiser BDs et cholangiocytes non incorporés dans le foie de souris. Un anticorps contre l’actine musculaire alpha-lisse est ajouté à la coloration pour étiqueter les vaisseaux. L’analyse systématique du rapport BD/PV dans une section couvrant tous les lobes du foie garantit qu’un grand nombre de PV sont analysés pour chaque génotype. Étant donné que notre méthode repose sur la quantification des BD et des PV en images 2D, elle n’est pas adaptée pour étudier les effets d’une mutation donnée sur la structure 3D de l’arbre biliaire ou l’intégrité des petits conduits biliaires. Néanmoins, il fournit une stratégie simple et objective pour les chercheurs d’évaluer le développement biliaire chez la souris.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’analyse du développement et de la réparation de BD chez les souris est un outil important en étudiant la pathogénie et le mécanisme des désordres cholestatic. En outre, le développement de nouvelles thérapies dépend en partie de l’établissement d’un phénotype reproductible et de préférence quantifiable. Le phénotypage actuel dans les modèles de souris implique habituellement la chimie de sérum, l’histologie de foie et l’immunostaining pour des marqueurs spécifiques de cellules-type. Bien que ces techni…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs reconnaissent le soutien des National Institutes of Health (NIH) (R01 GM084135 et R01 DK109982), un Prix pilote/faisabilité du Texas Medical Center Digestive Disease Center sous NIH P30 DK56338, et un Alagille Syndrome Accelerator Award de La Fondation Médicale.
Materials
| Isothesia (Isoflurane) | Henry Schein | 11695-6776-2 | |
| Desiccator | Bel-Art | 16-800-552 | |
| 10% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15712 | |
| 50mL tube | ThermoScientific | 339653 | |
| 70% Ethanol | Decon Laboratories | 2401 | |
| 95% Ethanol | Decon Laboratories | 2801 | |
| 100% Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | |
| HistoChoice | VWR Life Sciences | H103-4L | clearing agent |
| Omnisette Tissue Cassette | Fisher HealthCare | 15-197-710E | |
| Macrosette | Simport | M512 | |
| Paraplast X-TRA | McCormick Scientific | 39503002 | Parrafin |
| Tissue Mold | Fisher Scientific | 62528-32 | |
| Microtome | Microm | HM 325 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Xylene | Fisher Scientific | C8H10 | |
| Tris-Based Antigen Retrieval | Vector Laboratories | H-3301 | |
| Pressure Cooker | Instant Pot | Lux Mini | |
| Mini Pap Pen | Life Technologies | 8877 | |
| Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20) | J.T. Baker | X251-07 | |
| Octyl Phenol Ethoxylate (Triton-X-100) | J.T. Baker | X198-07 | |
| Normal Goat Serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
| anti-CK8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I | Antibody Registry ID AB531826 |
| anti-CK19 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-III | Antibody Registry ID AB2133570 |
| anti-αSMA | Sigma Aldrich | A2547, Clone 1A4 | |
| anti-rat-Alexa488 | ThermoFisher | A21208 | |
| anti-mouse-Cy5 | Jackson Immunoresearch | 715-175-151 | |
| DAPI | Vector Laboratories | H-1000 | |
| 22×50 micro cover glass | VWR Life Sciences | 48393 059 | |
| Fluorescence Microscope | Leica | DMI6000 B | |
| Kimwipes | Kimtech Science | 05511 | |
| VECTASHIELD | Vector Laboratories | H-1000 | Antifade Mounting Medium |
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