Determinando a densidade do ducto biliar no fígado do rato

Summary

Nós apresentamos um método rather simples e sensível para a quantificação exata da densidade do colagogo no fígado do rato. Este método pode ajudar a determinar os efeitos dos modificadores genéticos e ambientais e a eficácia de terapias potenciais em modelos de camundongo de doenças biliares.

Abstract

O rato é amplamente utilizado como um organismo modelo para estudar as doenças biliares. Para avaliar o desenvolvimento e a função do sistema biliar, diversas técnicas são usadas, incluindo a química do soro, a análise histológica, e a imunomarcação para marcadores específicos. Embora essas técnicas possam fornecer informações importantes sobre o sistema biliar, muitas vezes não apresentam um quadro completo de defeitos de desenvolvimento do ducto biliar (BD) em todo o fígado. Isto é em parte devido à habilidade robusta do fígado do rato para drenar a bilis mesmo nos animais com prejuízo significativo no desenvolvimento biliar. Aqui nós apresentamos um método simples para calcular o número médio de BDs associados com cada veia portal (picovolt) nas seções que cobrem todos os lóbulos de ratos mutantes/transgenic. Neste método, os fígados são montados e seccionados de forma estereotipado para facilitar a comparação entre vários genótipos e condições experimentais. Os BDs são identificados por meio de microscopia de luz de colangiócitos corados por citoqueratina e, em seguida, contados e divididos pelo número total de PVs presentes na seção hepática. Como exemplo, mostramos como esse método pode distinguir claramente entre camundongos de tipo selvagem e um modelo de rato da síndrome de Alagille. O método aqui apresentado não pode substituir técnicas que visualizem a estrutura tridimensional da árvore biliar. No entanto, oferece uma maneira fácil e direta de avaliar quantitativamente o desenvolvimento de BD e o grau de formação de reação ductular em camundongos.

Introduction

A árvore biliar é uma parte crítica do fígado de mamíferos, permitindo a passagem da bile de hepatócitos para o intestino. Os ductos biliares intrahepáticos (BDS) são formados por colangiócitos, que se diferenciam dos hepatoblastos bipotenciais através da sinalização de entalhe e TGFβ^1,2. A especificação e o compromisso apropriados dos colangiócitos e de seu conjunto em BDS maduros são críticos para o desenvolvimento da árvore biliar intrahepatic. Como o fígado cresce durante o desenvolvimento ou após a regeneração de órgãos, o sistema biliar precisa se desenvolver ao longo do fígado para garantir a drenagem biliar adequada. Além disso, um número de doenças sindrômica e não-sindrômica resultam no escassez de BDS intrahepatic³. Além disso, uma série de doenças hepáticas agudas e crônicas dão origem às chamadas reações ductulares no fígado, que são definidas como a presença de um número significativo de células que expressam marcadores biliares, mas não necessariamente surgem de células biliares ou forma patente BDs⁴. Na síndrome de Alagille do transtorno multisistema (algs), a haploinsuficiência do entalhe ligante jagged1 (JAG1) resulta em má formação de BD e colestase^5,6. Nosso laboratório demonstrou recentemente que uma linha Jag1 heterozygous previamente gerada⁷ do rato é um modelo animal de BD escassez em algs⁸. Neste modelo do rato de algs, os colangiócitos estão ainda atuais. No entanto, eles não conseguem se comprometer com a incorporação em maduro, patentes BDs⁸. Conseqüentemente, a análise do fígado em um modelo de BD escassez exige mais do que a presença ou a ausência aparente de cholangiocytes. É importante avaliar com precisão o grau em que os BDs maduros estão presentes no fígado.

Na patologia anatômica, existem métodos quantitativos aceitos para avaliar se a BD escassez existe⁹. Por exemplo, estudos sobre algs em pacientes humanos frequentemente quantificam a razão BD para veia porta (PV) analisando pelo menos 10 vasos portais por biópsia hepática^9,10. A análise da forma e a presença ou ausência geral de BDS de patentes, combinadas com a química sérica, podem fornecer informações valiosas sobre o desenvolvimento de BD em camundongos^11,12,13. No entanto, os camundongos podem perder um número significativo de BDs com apenas um aumento modesto no nível de bilirrubina sérica⁸. Assim, um método quantitativo que avalia o número de BDS presentes por PV pode fornecer uma medida mais direta do grau de BD escassez em camundongos. Em um relatório recente, nós quantificamos o número de BDs por o picovolt através de todos os lóbulos do fígado e relatamos uma diminuição significativa na relação do BD ao picovolt em Jag1 +/- animais⁸. No decorrer de nossa análise, observamos que, apesar da significativa variação do grau de resposta inflamatória e das reações ductulares, a relação BD com PV não mostra muita variabilidade⁸. Além disso, a quantificação da relação BD para PV permitiu demonstrar que a remoção de uma cópia do gene glicosiltransferase Poglut1 em Jag1 +/– animais pode melhorar significativamente a sua BD escassez⁸. Em um fundo Jag1 +/+ , a perda condicional de Poglut1 em células musculares lisas vasculares resulta em um aumento progressivo nos números de BD, o que é modesto (20-30%) no P7, mas torna-se proeminente em adultos⁸. Mais uma vez, esta técnica permitiu-nos mostrar que, mesmo em P7, o aumento da densidade de BD nesses animais é estatisticamente significante. Da nota, a densidade aumentada do BD neste genótipo em quatro meses da idade foi validada com a análise do molde da resina também. ⁸ estas observações e outros relatórios que mediram a densidade do BD em modelos diferentes do rato de algs^14,15 alertaram-nos incorporar este método em nossa estratégia total para analisar defeitos biliares em vários mutantes e camundongos transgênicos.

Aqui, detalhamos uma técnica direta que pode ser usada para examinar o grau de BD escassez em modelos de camundongo de doença hepática (Figura 1). Neste método, a cocoloração com marcadores de colangiócitos citoqueratina (CK) 8 e CK19 (a seguir CK de largo espectro, wsCK) é usada para visualizar BDs e colangiócitos não incorporados no fígado do mouse. Um anticorpo de encontro ao actínio alfa-liso do músculo (αSMA) é adicionado à mancha para etiquetar embarcações. A análise sistemática da relação BD para PV em uma seção que abrange todos os lóbulos hepáticos assegura que um grande número de PVs seja analisado para cada genótipo. Como nosso método depende da quantificação de BDs e PVs em imagens 2D, não é adequado para estudar os efeitos de uma determinada mutação na estrutura 3D da árvore biliar ou a integridade das pequenas condutas biliares. Não obstante, fornece uma estratégia simples e objetiva para que os investigadores avaliem o desenvolvimento biliar no rato.

Protocol

Todos os animais foram alojados em uma instalação de barreira animal no Baylor College of Medicine por diretrizes institucionais de cuidado animal e uso do Comitê e protocolos de animais aprovados. 1. coleção do tecido do fígado do rato Preparação do rato para a colheita do fígado Eutanizar o rato usando isoflurano. Realize luxação cervical do mouse para garantir a morte. Faça uma incisão transversal aproximadamente uma p…

Representative Results

Nós documentamos previamente defeitos biliares em Jag1 +/- Animals, um modelo do rato de algs8. Para determinar a relação BD com PV, nós seccionamos os fígados do mouse p30 e os cortinos para CK8 e CK19 (wsCK), juntamente com o marcador vascular αSMA. Nós então imaged todos os PVs em cada um dos lóbulos do fígado. Como mostrado na Figura 2a, definimos PVS como vasos manchados de αsma que têm coloração de wsck adj…

Discussion

A análise do desenvolvimento e reparo da BD em camundongos é uma importante ferramenta para estudar a patogênese e o mecanismo de distúrbios colestáticos. Além, o desenvolvimento de terapias novas é na parte dependente em cima de estabelecer um phenotype reprodutível e preferivelmente quantificáveis. A fenotipagem atual em modelos de mouse geralmente envolve química sérica, histologia hepática e imunocoloração para marcadores específicos do tipo celular. Embora essas técnicas gerem informações valiosas …

Materials

Isothesia (Isoflurane)	Henry Schein	11695-6776-2
Desiccator	Bel-Art	16-800-552
10% PFA	Electron Microscopy Sciences	15712
50mL tube	ThermoScientific	339653
70% Ethanol	Decon Laboratories	2401
95% Ethanol	Decon Laboratories	2801
100% Ethanol	Decon Laboratories	2701
HistoChoice	VWR Life Sciences	H103-4L	clearing agent
Omnisette Tissue Cassette	Fisher HealthCare	15-197-710E
Macrosette	Simport	M512
Paraplast X-TRA	McCormick Scientific	39503002	Parrafin
Tissue Mold	Fisher Scientific	62528-32
Microtome	Microm	HM 325
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Xylene	Fisher Scientific	C8H10
Tris-Based Antigen Retrieval	Vector Laboratories	H-3301
Pressure Cooker	Instant Pot	Lux Mini
Mini Pap Pen	Life Technologies	8877
Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20)	J.T. Baker	X251-07
Octyl Phenol Ethoxylate (Triton-X-100)	J.T. Baker	X198-07
Normal Goat Serum	Jackson Immunoresearch	005-000-121
anti-CK8	Developmental Studies Hybridoma Bank	TROMA-I	Antibody Registry ID AB531826
anti-CK19	Developmental Studies Hybridoma Bank	TROMA-III	Antibody Registry ID AB2133570
anti-αSMA	Sigma Aldrich	A2547, Clone 1A4
anti-rat-Alexa488	ThermoFisher	A21208
anti-mouse-Cy5	Jackson Immunoresearch	715-175-151
DAPI	Vector Laboratories	H-1000
22×50 micro cover glass	VWR Life Sciences	48393 059
Fluorescence Microscope	Leica	DMI6000 B
Kimwipes	Kimtech Science	05511
VECTASHIELD	Vector Laboratories	H-1000	Antifade Mounting Medium