Utilizzo della radioetichettatura microtiter Piatto per le misurazioni multiple In Vivo di Escherichia coli (p)ppGpp seguito dalla cromatografia a strati sottile

Sommario

La crescita di colture batteriche radioetichettate nei piatti microtiteri facilita il campionamento ad alta produttività che consente molteplici analisi tecniche e biologiche di abbondanza di piscine nucleotidiche, tra cui quella di (p)ppGpp. Gli effetti delle transizioni di crescita provocati da fonti di stress fisiologico e di recupero dallo stress possono essere monitorati.

Abstract

Il nucleotide (p)ppGpp funziona come regolatore globale nei batteri in risposta a una varietà di stress fisico e nutrizionale. Ha un rapido insorgenza, in secondi, che porta ad accumulo di livelli che si avvicinano o superano quelli dei pool GTP. L'inversione dello stress è una rapida scomparsa di (p)ppGpp, spesso con un'emivita di meno di un minuto. La presenza di (p)ppGpp provoca alterazioni dell'espressione genica cellulare e del metabolismo che contrastano gli effetti dannosi dello stress. I batteri Gram-negativi e Gram-positivi hanno meccanismi di risposta diversi, ma entrambi dipendono dalla concentrazione (p)ppGpp. In ogni caso, è necessario monitorare contemporaneamente molte colture batteriche radioetichettate a intervalli di tempo che possono variare da 10 secondi a ore durante i periodi di transizione allo stress critico. Questo protocollo affronta questa sfida tecnica. Il metodo si avvale di incubatori di microtitori a temperatura e a scossore che consentono un monitoraggio parallelo della crescita (assorbimento) e di un rapido campionamento di colture uniformemente radioetichettate con fosfato per risolvere e quantitare le pool di nucleotidi cromatografia a strato sottile sulla cellulosa PEI. Piccole quantità di campione sono necessarie per molteplici repliche tecniche e biologiche delle analisi. Con questo metodo è possibile valutare quantitativamente transizioni complesse di crescita, come la crescita diaustica e i tassi di rotazione rapidi (p)ppGpp.

Introduzione

Il secondo messaggero (p)ppGpp è un regolatore globale che modula l'espressione di un gran numero di geni, compresi i geni per sintetizzare ribosomi e amminoacidi^1,2. Anche se inizialmente scoperto in Escherichia coli³, (p)ppGpp può essere trovato sia nei batteri Gram positivi e Gram negativi, così come nelle cloroplasti vegetali^4,5. Per E. coli e altri batteri Gram-negativi, (p)ppGpp interagisce direttamente con la polimerasi dell'RNA in due siti diversi^6,7<....

Protocollo

1. Preparazione dei supporti

1. Per moPS (3-(N-morpholino)propanesulfonic acid) media²⁵, utilizzare 1/10 volume di sali 10x MOPS, 1/100 volume di soluzione 100x micronutrienti, 3 mM fosfato di sodio per colture notturne o 0,2 mM di fosfato di sodio per un'etichettatura uniforme con ³²P, 0,2% di glucosio e 1 g/mL di tiano (vitamina B1). Se necessario, aggiungere gli amminoacidi a 40 g/mL.
   1. Per i salti MOPS, utilizzare 400 mM MOPS, 40 mM Tricine, 0,1 mM FeSO₄, 95 mM NH₄Cl, 2,6 mM K₂SO₄, 5 CaCl₂, 10,56 mM MgCl₂e 500 mM NaCl. Aggiungere i ....

Risultati

Nei ceppi E. coli K-12, l'aggiunta di valina provoca una fame endogena di isoleucina, che si traduce in un aumento dei livelli di ppGpp dopo 5 min³. Le cellule coltivate in MOPS contenenti tutti gli aminoacidi ad eccezione di ILV sono state etichettate con ³²P come indicato nella Figura 1. Una volta etichettato, sono stati aggiunti 6 L di 10 mg/mL L-valine (100 g/mL di concentrazione finale) per produrre la fame di isole. I campioni sono sta.......

Discussione

Raggiungere un'etichettatura quasi uniforme delle cellule è un passo fondamentale per questo protocollo. Pertanto, l'uso di supporti definiti, come i supporti MOPS o Tris, è fondamentale per consentire la variazione delle concentrazioni di fosfato del vettore e dell'attività specifica. Non è possibile utilizzare supporti memorizzati nel buffer del fosfato, ad esempio M9 o A. La maggior parte dei supporti indefiniti contiene quantità variabili di fosfato, come LB, tryptone e acidi casamino. L'isotopo fosfato ³³.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
(NH4)6(MO7)24	Fisher Scientifics	A-674
Pellicola per autoradiografia	Denville scientific inc.	E3218
CaCl2	J.T.Baker	1-1309
Cloramfenicolo	RPI	C61000-25.0
CoCl2	Fisher Scientifics	C-371
CuSO4	J.T.Baker	1843
FeSO4	Fisher Scientifics	I-146
Acido formico	Fisher Biotech	BP1215-500
Glucosio	Macron	4912-12
H3BO4	Macron	2549-04
H3PO4	J.T.Baker	0260-02
K2SO4	Sigma	P9458-250G
KH2PO4	Fisher Biotech	BP362-500
L-Valina	Sigma	V-6504
MgCl2	Fisher Scientifics	FL-06-0303
Lettore di micropiastre Synergy HT	Biotek	Synergy HT
MnCl2	Sigma	M-9522
MOPS	Sigma	M1254-1KG
Na2HPO4	Mallinckrodt	7892
NaCl	J.T.Baker	3624-01
NaH2PO4	Mallinckrodt	7917
NH4Cl	Sigma	A0171-500G
P-32 radionuclide, acido ortofosforico in 1 mL di acqua (5 mCi)	Perkin Elmer	NEX053005MC
Schermo al fosforo di stoccaggio	Kodak	So230
Thermomixer	Eppendorf	5382000015
Tiamina	Sigma	T-4625
TLC PEI Cellulosa F	Merk-Millipore	1.05579.0001
Tricine	RPI	T2400-500.0
Typhoon 9400 imager	GE Healthcare
ZnSO4	Fisher Scientifics	Z-68