Utilizzo della radioetichettatura microtiter Piatto per le misurazioni multiple In Vivo di Escherichia coli (p)ppGpp seguito dalla cromatografia a strati sottile
Summary
La crescita di colture batteriche radioetichettate nei piatti microtiteri facilita il campionamento ad alta produttività che consente molteplici analisi tecniche e biologiche di abbondanza di piscine nucleotidiche, tra cui quella di (p)ppGpp. Gli effetti delle transizioni di crescita provocati da fonti di stress fisiologico e di recupero dallo stress possono essere monitorati.
Abstract
Il nucleotide (p)ppGpp funziona come regolatore globale nei batteri in risposta a una varietà di stress fisico e nutrizionale. Ha un rapido insorgenza, in secondi, che porta ad accumulo di livelli che si avvicinano o superano quelli dei pool GTP. L’inversione dello stress è una rapida scomparsa di (p)ppGpp, spesso con un’emivita di meno di un minuto. La presenza di (p)ppGpp provoca alterazioni dell’espressione genica cellulare e del metabolismo che contrastano gli effetti dannosi dello stress. I batteri Gram-negativi e Gram-positivi hanno meccanismi di risposta diversi, ma entrambi dipendono dalla concentrazione (p)ppGpp. In ogni caso, è necessario monitorare contemporaneamente molte colture batteriche radioetichettate a intervalli di tempo che possono variare da 10 secondi a ore durante i periodi di transizione allo stress critico. Questo protocollo affronta questa sfida tecnica. Il metodo si avvale di incubatori di microtitori a temperatura e a scossore che consentono un monitoraggio parallelo della crescita (assorbimento) e di un rapido campionamento di colture uniformemente radioetichettate con fosfato per risolvere e quantitare le pool di nucleotidi cromatografia a strato sottile sulla cellulosa PEI. Piccole quantità di campione sono necessarie per molteplici repliche tecniche e biologiche delle analisi. Con questo metodo è possibile valutare quantitativamente transizioni complesse di crescita, come la crescita diaustica e i tassi di rotazione rapidi (p)ppGpp.
Introduction
Il secondo messaggero (p)ppGpp è un regolatore globale che modula l’espressione di un gran numero di geni, compresi i geni per sintetizzare ribosomi e amminoacidi1,2. Anche se inizialmente scoperto in Escherichia coli3, (p)ppGpp può essere trovato sia nei batteri Gram positivi e Gram negativi, così come nelle cloroplasti vegetali4,5. Per E. coli e altri batteri Gram-negativi, (p)ppGpp interagisce direttamente con la polimerasi dell’RNA in due siti diversi6,7,8. In Gram positivi, (p)ppGpp inibisce l’abbondanza GTP, che viene percepita da CodY, una proteina legante GTP con motivi di riconoscimento del DNA gene-specifici che portano al regolamento9,10. (p)ppGpp si accumula in risposta alla fame di diversi nutrienti e condizioni di stress, con conseguente crescita lenta e aggiustamenti dell’espressione genica per consentire l’adattamento allo stress11,12.
La quantità netta di ppGpp accumulata riflette un equilibrio tra le attività di sintetasi e idrolasi. In E. coli RelA è una forte sintetasi e SpoT è bifunzionale, con una forte idrolasi e una sintetasi debole, ognuna delle quali potrebbe essere regolata in modo diverso in modo dipendente dallo stress. La forte sintetasi RelA si attiva quando la disponibilità di tRNA carico carica specificato codone legato al sito ribosomal A quando non riesce a tenere il passo con le esigenze di sintesi proteica13,14,15. La debole sintetasi SpoT (p)ppGpp viene attivata mentre l’idrolasi forte (p)ppGpp è inibita in risposta ad altre condizioni di stress e attraverso altri meccanismi. In alcune condizioni, proteine come ACP o Rsd possono legarsi a SpoT, che cambia anche l’equilibrio tra idrolisi e sintesi16,17. Nei positivi Gram, sintesi e idrolisi riflettono un equilibrio più complesso tra una singola proteina relA SpoT (RSH) con forti attività di sintesi e idrolisi, nonché idrolasi e/o sintetasi più piccole12.
I nucleotidi (p)ppGpp sono stati scoperti per la prima volta come insoliti punti etichettati da 32P che sono apparsi sugli autoradiogrammi dei cromotrigrammi a strato sottile (TLC) durante una risposta rigorosa indotta dalla fame di amminoacido3. Sono stati esaminati protocolli di etichettatura più dettagliati 18. Il protocollo descritto qui (Figura 1) è una modifica di questi protocolli che consente di monitorare la crescita di più campioni su piastre di microtiteri. Questo facilita molteplici stime biologiche e tecniche dei cambiamenti di abbondanza (p)ppGpp ed è stato inizialmente sviluppato per studi sui cambiamenti diauxici19. L’etichettatura di (p)ppGpp con 32P e rilevamento da parte di TLC consente anche misurazioni dei tassi di degradazione (p)ppGpp. Sono stati sviluppati metodi alternativi per determinare i livelli (p)ppGpp come la spettrometria di massa, HPLC20, chemiosensori fluorescenti21,22e le fusioni geniali GFP per i promotori affetti da ppGpp23, 24. I chemiosensori fluorescenti hanno attualmente un uso limitato a causa di piccoli spostamenti spettrali dopo il legame ppGpp così come problemi che distinguono tra ppGpp e pppGpp21. Questo metodo è efficace per rilevare (p)ppGpp in vitro, ma non in estratti cellulari. I metodi che coinvolgono HPLC sono stati miglioratia 20 ma richiedono attrezzature costose e non sono ben adattati all’elevata velocità. Infine, le fusioni GFP possono fornire una stima dell’attivazione o dell’inibizione dipendente da ppGpp, ma non misurano la ppGpp stessa. Sebbene ciascuno di questi metodi alternativi sia prezioso, richiedono attrezzature costose o tempi di pratica sostanziali oppure non sono suscettibili di campionamento cinetico multiplo e di successiva elaborazione. Con il metodo qui descritto, 96 campioni possono essere applicati a sei piastre TLC in circa 20 min (18 campioni per piastra), risolti dallo sviluppo di TLC in meno di un paio d’ore, con dati quantitativi ottenuti dopo diverse ore o durante la notte, a seconda dell’etichettatura intensità.
Protocol
Representative Results
Discussion
Raggiungere un’etichettatura quasi uniforme delle cellule è un passo fondamentale per questo protocollo. Pertanto, l’uso di supporti definiti, come i supporti MOPS o Tris, è fondamentale per consentire la variazione delle concentrazioni di fosfato del vettore e dell’attività specifica. Non è possibile utilizzare supporti memorizzati nel buffer del fosfato, ad esempio M9 o A. La maggior parte dei supporti indefiniti contiene quantità variabili di fosfato, come LB, tryptone e acidi casamino. L’isotopo fosfato 33<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata sostenuta dal Programma di Ricerca Intramurale, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, NIH.
Materials
| (NH4)6(MO7)24 | Fisher Scientifics | A-674 | |
| Autoradiography film | Denville scientific inc. | E3218 | |
| CaCl2 | J.T.Baker | 1-1309 | |
| Chloramphenicol | RPI | C61000-25.0 | |
| CoCl2 | Fisher Scientifics | C-371 | |
| CuSO4 | J.T.Baker | 1843 | |
| FeSO4 | Fisher Scientifics | I-146 | |
| Formic acid | Fisher Biotech | BP1215-500 | |
| Glucose | Macron | 4912-12 | |
| H3BO4 | Macron | 2549-04 | |
| H3PO4 | J.T.Baker | 0260-02 | |
| K2SO4 | Sigma | P9458-250G | |
| KH2PO4 | Fisher Biotech | BP362-500 | |
| L-Valine | Sigma | V-6504 | |
| MgCl2 | Fisher Scientifics | FL-06-0303 | |
| Microplate reader Synergy HT | Biotek | Synergy HT | |
| MnCl2 | Sigma | M-9522 | |
| MOPS | Sigma | M1254-1KG | |
| Na2HPO4 | Mallinckrodt | 7892 | |
| NaCl | J.T.Baker | 3624-01 | |
| NaH2PO4 | Mallinckrodt | 7917 | |
| NH4Cl | Sigma | A0171-500G | |
| P-32 radionuclide, orthophosphoric acid in 1 mL water (5 mCi) | Perkin Elmer | NEX053005MC | |
| Storage phosphor screen | Kodak | So230 | |
| Thermomixer | Eppendorf | 5382000015 | |
| Thiamine | Sigma | T-4625 | |
| TLC PEI Cellulose F | Merk-Millipore | 1.05579.0001 | |
| Tricine | RPI | T2400-500.0 | |
| Typhoon 9400 imager | GE Healthcare | ||
| ZnSO4 | Fisher Scientifics | Z-68 |
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