Tillväxten av radiomärkade bakteriekulturer i mikrotiterrätter underlättar hög genomströmning provtagning som tillåter flera tekniska och biologiska replikat analyser av nukleotid pool överflöd, inklusive den av (p) ppGpp. Effekterna av tillväxt övergångar provoceras av källor till fysiologisk stress samt återhämtning från stress kan övervakas.
Den (p) ppGpp nukleotid fungerar som en global regulator i bakterier som svar på en mängd olika fysiska och näringsmässiga stress. Den har en snabb debut, i sekunder, vilket leder till ackumulering av nivåer som närmar sig eller överskrider de av GTP pooler. Stress återföring tillfällen en snabb försvinnande av (p) ppGpp, ofta med en halveringstid på mindre än en minut. Närvaron av (p) ppGpp resulterar i förändringar av cellulära genuttryck och metabolism som motverkar de skadliga effekterna av stress. Gramnegativa och grampositiva bakterier har olika responsmekanismer, men båda är beroende av (p) ppGpp-koncentration. Under alla omständigheter finns det ett behov av att samtidigt övervaka många radiomärkade bakteriekulturer vid tidsintervall som kan variera från 10 sekunder till timmar under kritiska stress övergångsperioder. Detta protokoll tar upp denna tekniska utmaning. Metoden utnyttjar temperatur-och shaker-kontrollerade mikrotiter skålen inkubatorer som möjliggör parallell övervakning av tillväxt (absorbans) och snabb provtagning av enhetligt fosfat-radiomärkade kulturer att lösa och kvantitera nukleotid pooler genom tunn skikts kromatografi på PEI-cellulosa. Små mängder prov behövs för flera tekniska och biologiska replikat av analyser. Komplexa tillväxt övergångar, såsom diauxic tillväxt och Rapid (p) ppGpp omsättningshastighet kan kvantitativt bedömas med denna metod.
Den (p) ppgpp andra budbärare är en global regulator som modulerar uttrycket av ett stort antal gener, inklusive gener för syntetisera ribosomer och aminosyror1,2. Även initialt upptäcktes i Escherichia coli3, (p) ppgpp kan hittas i både grampositiva och gramnegativa bakterier samt i växternas kloroplaster4,5. För E. coli och andra gramnegativa bakterier, (p) ppgpp interagerar direkt med RNA-polymeras på två olika platser6,7,8. I grampositiva, (p) ppgpp hämmar GTP överflöd, som är kände av CodY, ett GTP-bindande protein med genspecifika DNA-igenkännings motiv som leder till regel9,10. (p) ppgpp ackumuleras som svar på svält för olika näringsämnen och stressförhållanden, vilket resulterar i långsam tillväxt och justeringar av genuttryck för att möjliggöra anpassning till stress11,12.
Nettobeloppet för ackumulerade ppgpp återspeglar en balans mellan–syntetas och hydrolas verksamhet. I E. coli RelA är en stark–syntetas och SpoT är bifunktionell, med en stark hydrolas och en svag syntetas, som var och en kan regleras på olika sätt i en stress beroende sättet. Den starka RelA-Synthetasen aktiveras när tillgängligheten av Codon-specificerade laddade tRNA som är destinerade till ribosomalen en plats, när den underlåter för att hänga upp med kraven av proteinsyntes13,14,15. Den svaga punkten (p) ppGpp-syntetas aktiveras medan den starka (p) ppGpp-hydrolasen hämmas som svar på andra stressförhållanden och genom andra mekanismer. Under vissa förhållanden, proteiner som ACP eller RSD kan binda till SpoT, som också ändra balansen mellan hydrolys och syntes16,17. I grampositiva speglar syntes och hydrolys en mer komplex balans mellan ett enda RelA-protein med stark syntes och hydrolysverksamhet samt mindre Hydrolaser och/eller synthetaser12.
Den (p) ppGpp nukleotider upptäcktes först som ovanliga 32p märkta fläckar som dök upp på autoradiograms av tunnskiktskromatogram (TLC) under ett strikt svar induceras av aminosyra svält3. Mer detaljerade märkningsprotokoll har granskats 18. Det protokoll som beskrivs här (figur 1) är en modifiering av dessa protokoll som gör det möjligt att övervaka tillväxten av flera prover på mikrotiterplattor. Detta underlättar flera biologiska och tekniska uppskattningar av (p) ppGpp överflöd förändringar och utvecklades ursprungligen för studier av diauxic Skift19. Märkning av (p) ppGpp med 32p och detektion genom TLC medger också mätning av (p) ppgpp nedbrytningshastigheter. Alternativa metoder har utvecklats för att fastställa (p) ppGpp-nivåer såsom masspektrometri, HPLC20, fluorescerande kemosensorer21,22och GFP-genfusioner till projektansvariga som drabbats av ppgpp23, 24. fluorescerande chemosensors har för närvarande en begränsad användning på grund av små spektralskift efter bindande ppgpp samt problem att skilja mellan ppgpp och pppgpp21. Denna metod är effektiv för att upptäcka (p) ppGpp in vitro, men inte i cellulära extrakt. Metoder med HPLC har förbättrats20 men kräver dyr utrustning och är inte väl anpassade till hög genom-put. Slutligen, GFP fusioner kan ge en uppskattning av ppGpp beroende aktivering eller hämning, men inte mäta ppGpp själv. Medan var och en av dessa alternativa metoder är värdefulla, de kräver dyr utrustning eller betydande hands-on tid, eller de är annars inte mottagliga för flera kinetiska provtagning och efterföljande bearbetning. Med den metod som beskrivs här, 96 prover kan appliceras på sex TLC plattor i ca 20 min (18 prover per tallrik), lösas av TLC utveckling på mindre än ett par timmar, med kvantitativa data som erhållits efter flera timmar eller över natten, beroende på märkning Intensitet.
Att uppnå nära enhetlig märkning av cellerna är ett kritiskt steg för detta protokoll. Därför är användningen av definierade medier, såsom moppar eller Tris media, avgörande för att möjliggöra variation av bärare av fosfat koncentrationer och specifik aktivitet. Fosfatbuffrat media, till exempel M9 eller media A, kan inte användas. De flesta odefinierade medierna innehåller varierande mängder fosfat, såsom LB, trypton och casamino syror. Fosfat isotopen 33p är en svagare EMITTER som kan ers…
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning stöddes av intramural forsknings program, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health och Human Development, NIH.
(NH4)6(MO7)24 | Fisher Scientifics | A-674 | |
Autoradiography film | Denville scientific inc. | E3218 | |
CaCl2 | J.T.Baker | 1-1309 | |
Chloramphenicol | RPI | C61000-25.0 | |
CoCl2 | Fisher Scientifics | C-371 | |
CuSO4 | J.T.Baker | 1843 | |
FeSO4 | Fisher Scientifics | I-146 | |
Formic acid | Fisher Biotech | BP1215-500 | |
Glucose | Macron | 4912-12 | |
H3BO4 | Macron | 2549-04 | |
H3PO4 | J.T.Baker | 0260-02 | |
K2SO4 | Sigma | P9458-250G | |
KH2PO4 | Fisher Biotech | BP362-500 | |
L-Valine | Sigma | V-6504 | |
MgCl2 | Fisher Scientifics | FL-06-0303 | |
Microplate reader Synergy HT | Biotek | Synergy HT | |
MnCl2 | Sigma | M-9522 | |
MOPS | Sigma | M1254-1KG | |
Na2HPO4 | Mallinckrodt | 7892 | |
NaCl | J.T.Baker | 3624-01 | |
NaH2PO4 | Mallinckrodt | 7917 | |
NH4Cl | Sigma | A0171-500G | |
P-32 radionuclide, orthophosphoric acid in 1 mL water (5 mCi) | Perkin Elmer | NEX053005MC | |
Storage phosphor screen | Kodak | So230 | |
Thermomixer | Eppendorf | 5382000015 | |
Thiamine | Sigma | T-4625 | |
TLC PEI Cellulose F | Merk-Millipore | 1.05579.0001 | |
Tricine | RPI | T2400-500.0 | |
Typhoon 9400 imager | GE Healthcare | ||
ZnSO4 | Fisher Scientifics | Z-68 |