Cette méthode décrit une préparation chronique qui permet un accès optique à l’hippocampe de souris vivantes. Cette préparation peut être utilisée pour effectuer l’imagerie optique longitudinale de la plasticité structurale neuronale et de la plasticité cellulaire suscitée par l’activité sur une période de plusieurs semaines.
La microscopie à deux photons est un outil fondamental pour les neurosciences car elle permet d’enquêter sur le cerveau d’animaux vivants à des échelles spatiales allant des niveaux subcellulaires aux niveaux de réseau et à des échelles temporelles de millisecondes à semaines. En outre, l’imagerie à deux photons peut être combinée avec une variété de tâches comportementales pour explorer les relations causales entre la fonction cérébrale et le comportement. Cependant, chez les mammifères, la pénétration limitée et la diffusion de la lumière ont limité l’imagerie intravitale à deux photons principalement aux régions superficielles du cerveau, empêchant ainsi l’investigation longitudinale des zones du cerveau profond comme l’hippocampe. L’hippocampe est impliqué dans la navigation spatiale et la mémoire épisodique et est un modèle de longue date utilisé pour étudier les processus cellulaires ainsi que cognitifs importants pour l’apprentissage et le rappel, à la fois dans la santé et la maladie. Ici, une préparation qui permet un accès optique chronique à l’hippocampe dorsal chez les souris vivantes est détaillée. Cette préparation peut être combinée avec l’imagerie optique à deux photons à la résolution cellulaire et subcellulaire dans la tête fixe, souris vivantes anesthésiées sur plusieurs semaines. Ces techniques permettent l’imagerie répétée de la structure neuronale ou de la plasticité suscitée par l’activité dans des dizaines à des centaines de neurones dans le CA1 hippocampal dorsal. En outre, cette préparation chronique peut être utilisée en combinaison avec d’autres techniques telles que la micro-endoscopie, la microscopie à champ large monté sur la tête ou la microscopie à trois photons, élargissant ainsi considérablement la boîte à outils pour étudier les processus cellulaires et réseau impliqués. dans l’apprentissage et la mémoire.
Chez les mammifères, l’hippocampe est une région clé du cerveau pour l’encodage et le rappel des souvenirs épisodiques ainsi que pour la navigation spatiale1,2,3,4. Pour cette raison, l’hippocampe a été – et est toujours – un modèle très important pour étudier les mécanismes de base qui permettent au cerveau d’encoder et de rappeler des souvenirs5,6,7 ou de naviguer dans un environnement8 ,9 collecter des récompenses et éviter les dangers. En outre, la formation hippocampique est l’une des régions du cerveau où de nouveaux neurones sont générés tout au long de la vie des rongeurs10,11 et, éventuellement, des humains12,13. Enfin, la dégénérescence ou l’affaiblissement de la formation hippocampique sont associés à des troubles neurologiques et psychiatriques, y compris la maladie d’Alzheimer14.
Chez la souris, l’hippocampe est situé à environ 1 mm sous la surface du cerveau15. Sa position a empêché l’accès optique dans le cerveau intact et par conséquent, les études longitudinales de la dynamique hippocampal se sont appuyées principalement sur l’imagerie de résonance magnétique (MR), l’électrophysiologie, et les analyses ex vivo d’imagerie. Les méthodes d’imagerie par M. permettent de suivre les processus biologiques (p. ex., l’expression génique changede 16) chez le même animal sur plusieurs jours, mais n’ont pas la résolution spatiale pour discriminer les neurones uniques. Les techniques électrophysiologiques in vivo classiques offrent une résolution temporelle très élevée et une sensibilité exquise aux changements du potentiel membranaire. Cependant, ils ont une résolution spatiale limitée et ils n’ont pas la capacité de suivre de façon fiable les mêmes cellules sur de plus longues périodes de temps. L’imagerie optique permet d’étudier des processus plus diversifiés en raison de ses résolutions temporelles et spatiales élevées. Cependant, l’imagerie ex vivo ne fournit que des instantanés des processus en cours, et donc elle n’est pas adaptée aux études longitudinales au cours desquelles les animaux apprennent et rappellent l’information.
L’imagerie optique in vivo combine certains avantages de l’imagerie par résonance magnétique et de l’électrophysiologie avec ceux de l’imagerie optique. Par conséquent, il est très bien adapté pour les analyses longitudinales et corrélatives de la dynamique et du comportement du cerveau de la souris. Ceci est pertinent dans les études des processus biologiques avec des échelles de temps très rapides (millisecondes à secondes) ou très lentes (de jours à semaines). Les exemples de tels processus qui sont pertinents pour les neurosciences sont la dynamique de tension membranaire, les transitoires Ca2, la plasticité cellulaire et les changements structurels, qui sont tous considérés comme très importants pour la formation et le rappel de la mémoire. Différentes méthodes ont étendu l’imagerie in vivo à l’hippocampe dorsal18,19,20,21,22. Les préparations aigues ont permis le suivi de l’activité des neurones pyramidaux (PN) ainsi que de leurs dendrites et épines dendritiques pendant plusieurs heures20,22. Ce calendrier temporel, cependant, ne permet pas d’étudier les changements structurels à long terme, qui pourraient sous-tendre l’apprentissage progressif. Les préparations chroniques – en combinaison avec des micro-endoscopes23,24 ou avec des objectifs de microscope standard à longue distance de travail (WD)21 – ont permis l’imagerie répétée de l’hippocampe dorsal sur plusieurs Semaines.
Ici, nous décrivons une préparation chronique qui fournit l’accès optique récurrent au sous-champ CA1 de l’hippocampe dorsal des souris vivantes utilisant une canule d’imagerie insérée de façon permanente. Cette préparation permet un accès répété au CA1 sans perturbation fonctionnelle et convient à l’imagerie intravitale à deux photons (2P) ou à l’épifluorescence à champ large. Deux exemples de l’imagerie chronique profonde de cerveau 2P dans le CA1 dorsal des souris vivantes sont détaillés : imagerie longitudinale de la structure dendritique et de la dynamique de la colonne vertébrale dendritique et imagerie longitudinale de la plasticité suscitée par l’activité. Les avantages saillants et les limites de la technique sont discutés.
Ici, une procédure pour la formation image 2P répétée du CA1 dorsal chez les souris vivantes est décrite. Après la chirurgie, la souris récupère habituellement dans les 2 jours. La procédure induit un minimum d’astrogliose26,43. L’hémorragie et l’odema qui pourraient suivre la chirurgie sont habituellement ré-adsorbés dans un délai de 10 à 14 jours. En général, à partir de 14 jours après l’implantation, la préparation est suffisamment claire pour effectuer une imagerie intravitale. Le succès de la chirurgie ne dépend pas de travailler dans un environnement stérile. Cependant, il est crucial de maintenir un niveau élevé d’hygiène, pour éviter les complications dues aux infections associées à la chirurgie. Ceci est obtenu en nettoyant méticuleusement les instruments chirurgicaux avant et après la chirurgie et en les stérilisant à la chaleur immédiatement avant chaque utilisation (étape 2.1.1). La canule optique est conservée dans un récipient propre et stérilisé et rincée avec de la saline stérile juste avant l’implantation. L’exécution des pratiques chirurgicales communes de désinfection des mains et le nettoyage de la station chirurgicale est également très important. La préparation reste stable et permet l’imagerie par résolution cellulaire et subcellulaire pendant plusieurs semaines26,35.
Étapes critiques, modifications et dépannage.
Il est important de peler la capsule externe jusqu’à ce que les fibres les plus profondes soient exposées. Le défaut d’exposer l’alvée pourrait entraîner l’incapacité de se concentrer sur le soma des PN, ou dans des épines dendritiques d’imagerie à résolution réduite, lors de l’utilisation d’objectifs commerciaux avec DEO de 3 ou 4 mm. À cet effet, il est utile d’aérer le néocortex très lentement à l’aide d’une aiguille de 0,9 mm de diamètre, puis de passer à une aiguille de 0,3 à 0,5 mm de diamètre (24-29 jauge) pour un contrôle plus fin de l’aspiration lors de l’enlèvement des fibres les plus dorsales. Alternativement, les forceps fins peuvent être employés pour enlever le cortex restant après exposition de fibre36.
Saignement pendant la chirurgie peut être problématique, comme le sang obstrue la vue. Il est recommandé d’attendre que le caillot se forme, puis de rincer à la saline pour laver le sang résiduel. Répétez au besoin.
Un ajustement serré entre la canule et la craniotomie aide à augmenter la stabilité de la préparation en maintenant la canule en place avant l’application du ciment, surtout si le bord externe de la canule est rincer avec le crâne. Étant donné que les tailles de la perceuse de tréphine et de la canule sont assorties, un ajustement lâche peut surgir en raison d’irrégularités sur le côté de la canule – qui nécessitent des craniotomies légèrement plus grandes pour s’adapter (voir l’étape 2.3.14) – ou d’une craniotomie irrégulière. Toute irrégularité de canule doit être déposée (étapes 1.3 et 1.12) et la tréphine doit être maintenue perpendiculaire au crâne jusqu’à ce que la craniotomie soit terminée (étape 2.3.12). L’enlèvement de la tréphine du crâne avant que la craniotomie soit terminée peut entraîner des craniotomies irrégulières.
Limitations- Invasivité et stabilité de la préparation.
Il est difficile d’évaluer l’effet de l’ablation corticale car il est difficile de définir avec précision les zones touchées directement et indirectement. En général, la chirurgie enlève une partie du cortex pariétal et une partie du cortex sensoriel visuel et postérieur21. Le cortex ablated ne projette pas directement à l’hippocampe et le tissu hippocampal n’est ni touché ni blessé. Fait important, il a été démontré que l’implantation d’une canule d’imagerie ne modifie pas grossièrement la fonction hippocampique et plus particulièrement l’apprentissage hippocampique-dépendant21,36,37,38, 39. Pourtant, il serait important de quantifier dans quelle mesure la canule et la partie externe de l’implant (plaque de porte-tête et capuchon acrylique dentaire) sont des facteurs de stress chroniques en évaluant les taux sanguins de corticostérone et le poids des glandes surrénales par rapport à souris non implantées.
La préparation reste généralement stable de semaines à26mois. À long terme, la croissance de la peau et des os tend à déplacer le capuchon acrylique et à augmenter l’instabilité de la préparation de la formation image.
Limites optiques.
La microscopie 2P conventionnelle permet l’imagerie jusqu’à environ 1 mm de profondeur dans le tissu néocortical40,41. Conformément à cela, il est possible d’image dendrites et d’épines dendritiques situées dans le SR (Figure 2D-F) ou SLM36. Cependant, l’imagerie par une canule pose des limites à l’AnA efficace. Pour atteindre la résolution maximale, le diamètre et la profondeur des canules d’imagerie doivent être appariés à l’imagerie NA, car de plus petits diamètres et des profondeurs plus longues couperont la lumière des objectifs élevés de NA. Par exemple, lors de l’imagerie avec un objectif d’immersion de 1,0 NA à travers une canule de 1,6 mm de long, un diamètre intérieur de 3,65 mm est nécessaire pour garder la NA complète. Cependant, l’utilisation d’une canule de ce diamètre augmentera la compression sur l’hippocampe et pourrait affecter la santé du tissu, pour cette raison, nous utilisons une canule avec un diamètre plus petit. Lors de l’imagerie avec un objectif d’immersion de l’eau de 0,8 NA à travers une canule de 1,6 mm de long, un diamètre intérieur de 2,5 mm serait suffisant pour garder la NA complète. Cependant, 0,8 NA objectifs d’immersion de l’eau ont un DEO plus court (3 mm dans notre cas), qui peut empêcher de se concentrer à la SP.
Ces calculs s’appliquent au centre du champ de vision au bas de la canule. Cependant, déplacer le champ d’imagerie de la vue latéralement – plus près des bords de la canule – ou se concentrer plus profondément dans le tissu – plus loin de la surface de verre de la canule – diminue encore l’Accès NA efficace au plan focal et réduit ainsi la résolution. Cela conduira à une résolution non homogène à travers les différents volumes de tissus imaged et peut être un sujet de préoccupation pour l’imagerie quantitative à la résolution subcellulaire, en particulier lors de l’utilisation de techniques de super-résolution telles que la microscopie 2P-STED42. Ces questions sont moins importantes lors de l’imagerie à la résolution cellulaire.
Mouvement des tissus.
Le mouvement à l’intérieur du tissu – provenant de la respiration et du rythme cardiaque chez les animaux anesthésiés – tend à devenir plus grave avec une distance accrue de la canule d’imagerie. C’est peut-être parce que la canule d’imagerie applique une pression mécanique sur le cerveau contrecarrant ainsi une partie du mouvement à proximité de la canule (de la même façon que les préparations néocorticales). Ainsi, bien que l’imagerie des épines dendritiques soit possible dans SR et SLM, dans nos mains, il est le plus robuste dorsale à l’SO jusqu’à 200 ‘m de la surface de la canule. Pour compenser le mouvement, nous utilisons des scanners résonnants et une moyenne hors ligne. Plusieurs images (4 à 6 répétitions) sont acquises par plan d’image d’une z-pile à la vitesse maximale disponible (30 images/s). Toutes les répétitions pour chaque z-plan sont ensuite décongestionnées (à l’aide du logiciel commercial, AutoQuant), enregistrées (à l’aide d’ImageJ) et moyennes en une seule image26. Pour l’imagerie de somata, le mouvement est souvent négligeable sur l’anesthésie35 et deux moyennes sont souvent suffisantes pour compenser les artefacts de mouvement.
Applications ou orientations futures de la méthode .
La préparation peut être combinée avec des micro-endoscopes26,43. Les micro-endoscopes sont des sondes optiques rigides qui utilisent des microlenses d’indice de réfraction de gradient (GRIN) pour guider la lumière vers et depuis les tissus profonds18. L’utilisation de micro-endoscopes permet des canules de plus petits diamètres ou même pas de canules du tout. Cependant, les micro-endoscopes commerciaux sont moins bien corrigés pour les aberrations optiques et ont nA inférieur aux objectifs commerciaux. Les sondes actuelles atteignent des résolutions latérales et axiales de 0,6 à 1 m, 10-12 m, respectivement17,18,44. L’utilisation de micro-endoscopes permet également la combinaison de cette préparation avec des microscopes à large champ intégrés montés sur la tête45,46,47.
La méthode se prête également à l’utilisation chez les souris non anesthésiées, et il a été utilisé pour étudier l’activité cellulaire à l’aide de capteurs Ca2 chez les souris éveillées fixées à la tête21,37,48,49. Dans ces cas, en raison des délais rapides des changements de fluorescence, il est conseillé de mettre en œuvre l’enregistrement de ligne50. Il est également possible d’adapter la préparation à l’imagerie d’autres sous-régions hippocampiques telles que le gyrus denté (DG)39,51,52. Combinant cette préparation avec 3P excitation53,54 avec 1 MHz fréquence pulsée laser accordé à 1400 nm, nous avons pu imager plus profondément dans la formation hippocampal atteignant la couche moléculaire, la couche de cellules granules et le hilus du DG (Figure 4) sans enlever la superposition CA1.
En conclusion, nous présentons une méthode qui fournit un accès optique à l’hippocampe dorsal et permet des études longitudinales et corrélatives de la dynamique de la structure et de l’activité hippocampales. Cette technique élargit les possibilités d’analyse de la fonction hippocampique dans des conditions physiologiques et pathologiques.
The authors have nothing to disclose.
U. A. F. est soutenu par la fondation Schram; C.-W. T. P. et W. G. sont soutenus par la Max Planck Society; L.Y. et R.Y. sont soutenus par la Max Planck Society et le National Institute of Health (R01MH080047, 1DP1NS096787); A. C. est soutenu par une subvention du 7e PC du Conseil européen de la recherche, des programmes ERANET et I-CORE, du Bureau des scientifiques en chef du Ministère israélien de la Santé, du Ministère fédéral de l’éducation et de la recherche, Roberto et Renata Ruhman, Bruno et Simone Lich, Nella and Leon Benoziyo Center for Neurological Diseases, the Henry Chanoch Krenter Institute for Biomedical Imaging and Genomics, The Israel Science Foundation the Perlman Family, Adelis, Marc Besen, Pratt and Irving I. Moskowitz foundations; A. A. est soutenu par la Société Max Planck, la fondation Schram et la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). Les images 3P ont été acquises au cours advanced course on Neuroimaging Techniques au Max Planck Florida Institute for Neuroscience. Le cours avancé sur les techniques de neuroimagerie est soutenu par la Max Planck Society, le Florida State Max Planck Scientific Fellowship program et par le max Planck Florida Institute Corporation Partnership program. Nous tenons à remercier Thorlabs, Coherent et SpectraPhysics d’avoir fourni un soutien et de l’équipement pour le système d’imagerie 2P /3P pendant le cours. Nous sommes également reconnaissants à Henry Haeberle et Melissa Eberle pour leur aide au système pendant le cours.
Professional drill/grinder IBS/E | Proxxon GmbH | 28481 | Pecision drill |
MICROMOT drill stand MB 200 | Proxxon GmbH | 28600 | Movable ruler table |
MICRO compound table KT 70 | Proxxon GmbH | 27100 | Movable ruler table |
Machine vice MS 4 | Proxxon GmbH | 28132 | Movable ruler table |
Stainless steel tube Ø 3,0 x 0,25 mm (Inner Ø 2,5 mm ) L = 500 mm | Sawade | R00303 | Stainless steel tube for the cannula metal ring |
Microscope Cover glass (4 mm round) | Engelbrecht Medizin and Labortechnik | Glass coverslips for the cannula glass | |
Schlusselfeilensatz 6-tgl. Im Blechetui | Hoffmann Group | 713750 160 | Manual files |
Präzisions-Nadelfeile Gesamtlänge 140 mm 4 | Hoffmann Group | 527230 4 | Manual files |
UV-Curing Optical Adhesives | Thorlabs | NOA81 | UV-curing adhesive |
UV Curing LED System, 365 nm | Thorlabs | CS2010 | UV-curing LED driver unit |
Stemi 305 | Zeiss | Stereoscope | |
Presto II | NSK-Nakanishi Germany | Z307015 | Dental drill |
Diamantbohrer FG (5 St.), Zylinder flach, 837-014 fein | MF Dental | F837.014.FG | Files for the dental drill |
Diamantbohrer FG (5 St.), Zylinder flach, 837-014 grob | MF Dental | G837.014.FG | Files for the dental drill |
Graefe Forceps – Straight / Serrated | Fine Science Tools | 11050-10 | Forceps for the surgery |
Burrs for Micro Drill | Fine Science Tools | 19008-05 | 0.5 mm width burr for the micro-drill |
Burrs for Micro Drill | Fine Science Tools | 19008-09 | 0.9 mm width burr for the micro-drill |
MicroMotor mit Handstück | DentaTec | MM11 | Micro-drill for the craniotomy |
Dumont #3 Forceps | Fine Science Tools | 11231-30 | Dumont forceps for the surgery |
Fine Scissors – ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 | Scissors for the surgery |
Trephine | MW Dental | 229-020 | Trephine drill – 3.0 mm diameter; for the micro-drill |
Stainless Steel Self-Tapping Bone Screws | Fine Science Tools | 19010-10 | 0.86 mm width bone screws |
Stereotaxic apparatus | Kopf | Stereotaxic apparatus | |
3-D-Gelenkarm | Hoffmann Group | 442114 | Stereotaxic arm and plate holder |
Aufnahme 2SM | Hoffmann Group | 442100 2SM | Stereotaxic arm and plate holder |
Hot Bead Sterilizers | Fine Science Tools | 18000-45 | Glass beads sterilizer |
Isofluran CP, Flasche 250 ml | Henry Schein VET GmbH | 798932 | Liquid isoflurane for anesthesia |
Harvard Apparatus Isoflurane Funnel-Fill Vaporizer | Harvard Apparatus GmbH | 34-1040 | Isoflurane vaporizer |
Lab Active Scavenger | Gropper Medizintechnik | UV17014 | Isoflurane scavenger system |
Metacam 0,5% Injektionslsg. (Hund / Katze), Flasche 20 ml | Henry Schein VET GmbH | 798566 | Meloxicam, anti-inflammatory |
Vetalgin 500 mg/ml | MSD Tiergesundheit | Vetalgin, pain killer | |
CMA 450 Temperature Controller | Hugo Sachs Elektronik – Harvard Apparatus GmbH | 8003770 | Heating blanket |
Bepanthen Augen- und Nasensalbe | Bayer AG | Ophtalmic ointment | |
KL 1500 LCD | Schott | Fiber optic light source | |
Xylocain Pumpspray | AstraZeneca GmbH | Lidocain, local anesthetic | |
Absorption Triangles – Unmounted | Fine Science Tools | 18105-03 | Absorption triangles for the surgery |
Parkell C&B Metabond clear powder L | Hofmeester dental | 013622 | Quick adhesive cement |
Parkell C&B Metabond Quick Base B | Hofmeester dental | 013621 | Quick adhesive cement |
Parkell C&B Metabond Universal Catalyst C | Hofmeester dental | 013620 | Quick adhesive cement |
Adjustable Precision Applicator Brushes | Parkell | S379 | Precision applicators for the surgery |
Blunt needles 0.9×23 mm | Dentina | 0441324 | Blunt needles |
Blunt needles 0.5×42 mm | Dentina | 0452155 | Blunt needles |
Blunt needles 0.3×23 mm | Dentina | 0553532 | Blunt needles |
Kallocryl A/C | Speiko | 1615 | Acrylic liquid component |
Kallocryl | Speiko | 1609 | Acrylic powder |
Hydrofilm transparent roll | Hartmann | Adhesive film | |
Head plates | Custom made | 30 mm x 10 mm size; 8 mm diameter hole, titanium | |
Head plate clamp | Custom made | Head plate holder | |
Pedestal post holders | Thorlabs | PH20E/M | Head plate holder |
Stainless steel post | Thorlabs | TR30/M | Head plate holder |
Stainless steel post | Thorlabs | TR75/M | Head plate holder |
Stainless steel post | Thorlabs | TR150/M | Head plate holder |
Post connector clamps | Custom made | Head plate holder | |
Aluminum Breadboard, 300 mm x 450 mm x 12.7 mm, M6 Taps | Thorlabs | MB3045/M | Microscope stage |
7" x 4" Lab Jack | Thorlabs | L490/M | Microscope stage |
Low profile face mask small mice | Emka Technologies | VetFlo-0801 | Anesthesia facemask holder |
RS4000 Tuned Damped Top Performance Optical Table | Newport | Floating table | |
S-2000A Top Performance Pneumatic Vibration Isolators with Automatic Re-Leveling | Newport | Floating table | |
Power Meter Model 1918-R | Newport | Power meter | |
X-Cite 120Q | Excelitas Technologies | Fluorescence lamp | |
Two-photon microscope | Bruker | Ultima IV | Two-photon microscopes |
Two-photon microscope | Thorlabs | Bergamo | Two-photon microscopes |
Plan N 4x/0.10 ∞/-/FN22 | Olympus | Objectives | |
Plan N 10x/0.25 ∞/-/FN22 | Olympus | Objectives | |
LMPlan FLN 20x/0.40 ∞/-/FN26.5 | Olympus | Objectives | |
XLPlan N 25x/1.00 SVMP ∞/0-0.23/FN18 | Olympus | Objectives | |
Ultafast tunable laser for 2P excitation | Spectraphysics | Mai Tai Deep See | Excitaiton lasers |
Ultafast tunable laser for 2P excitation | Spectraphysics | InSight DS+ Dual beam | Excitaiton lasers |
Ultafast tunable laser for 3P excitation | Coherent | Monaco | Excitaiton lasers |