Questo metodo descrive una preparazione cronica che consente l’accesso ottico all’ippocampo di topi viventi. Questa preparazione può essere utilizzata per eseguire l’imaging ottico longitudinale della plasticità strutturale neuronale e della plasticità cellulare evocata dall’attività per un periodo di diverse settimane.
La microscopia a due fotoni è uno strumento fondamentale per le neuroscienze in quanto consente di soccorrere il cervello di animali vivi su scale spaziali che vanno dai livelli subcellulari aquelli di rete e su scale temporali da millisecondi a settimane. Inoltre, l’imaging a due fotoni può essere combinato con una varietà di compiti comportamentali per esplorare le relazioni causali tra la funzione cerebrale e il comportamento. Tuttavia, nei mammiferi, la penetrazione limitata e la dispersione della luce hanno un’imaging intravitale di due fotoni principalmente in regioni cerebrali superficiali, precludendo così lo studio longitudinale di aree del cervello profondo come l’ippocampo. L’ippocampo è coinvolto nella navigazione spaziale e nella memoria episodica ed è un modello di lunga data utilizzato per studiare i processi cellulari e cognitivi importanti per l’apprendimento e il richiamo, sia nella salute che nella malattia. Qui, una preparazione che consente l’accesso ottico cronico all’ippocampo dorsale nei topi viventi è dettagliata. Questa preparazione può essere combinata con l’imaging ottico a due fotoni a risoluzione cellulare e subcellulare in testa fissa, topi vivi anestesizzati per diverse settimane. Queste tecniche consentono l’imaging ripetuto della struttura neuronale o della plasticità evocata dall’attività in decine o centinaia di neuroni nell’ippocampale dorsale CA1. Inoltre, questa preparazione cronica può essere utilizzata in combinazione con altre tecniche come la micro-endoscopia, la microscopia a campo largo montata sulla testa o la microscopia a tre fotoni, espandendo così notevolmente la cassetta degli attrezzi per studiare i processi cellulari e di rete coinvolti nell’apprendimento e nella memoria.
Nei mammiferi, l’ippocampo è una regione chiave del cervello per la codifica e il richiamo di memorie episodiche e per la navigazione spaziale1,2,3,4. Per questo motivo, l’ippocampo è stato – ed è ancora – un modello molto importante per studiare i meccanismi di base che permettono al cervello di codificare e ricordare i ricordi5,6,7 o di navigare in un ambiente8 ,9 raccogliere ricompense ed evitare pericoli. Inoltre, la formazione dell’ippocampo è una delle regioni cerebrali in cui vengono generati nuovi neuroni per tutta la vita dei roditori10,11 e, eventualmente, degli esseri umani12,13. Infine, la degenerazione o la compromissione della formazione di ippocampali sono associati a disturbi neurologici e psichiatrici, tra cui il morbo di Alzheimer14.
Nei topi, l’ippocampo si trova a circa 1 mm sotto la superficie cerebrale15. La sua posizione ha impedito l’accesso ottico nel cervello intatto e, di conseguenza, gli studi longitudinali delle dinamiche ippocampali si sono affidati principalmente all’imaging a risonanza magnetica (MR), all’elettrofisiologia e alle analisi dell’imaging ex vivo. I metodi di imaging RM consentono di tracciare i processi biologici (ad esempio, l’espressione genica cambia16) nello stesso animale per più giorni, ma non hanno la risoluzione spaziale per discriminare i singoli neuroni. Le classiche tecniche elettrofisiologiche in vivo offrono una risoluzione temporale molto elevata e una squisita sensibilità ai cambiamenti nel potenziale della membrana. Tuttavia, hanno una risoluzione spaziale limitata e non hanno la capacità di tracciare in modo affidabile le stesse celle per periodi di tempo più lunghi. L’imaging ottico consente di studiare processi più diversificati in virtù delle sue elevate risoluzioni temporali e spaziali. Tuttavia, l’imaging ex vivo fornisce solo istantanee dei processi in corso, e quindi non è adatto per studi longitudinali durante i quali gli animali imparano e richiamano le informazioni.
L’imaging ottico in vivo combina alcuni vantaggi dell’imaging MR e dell’elettrofisiologia con quelli dell’imaging ottico. Pertanto, è molto adatto per analisi longitudinali e correlate delle dinamiche e del comportamento del cervello del topo. Questo è rilevante negli studi di processi biologici con scale temporali molto veloci (da millisecondi a secondi) o molto lente (da giorni a settimane). Esempi per tali processi che sono rilevanti per le neuroscienze sono la dinamica della tensione della membrana, i transitori Ca2,, la plasticità cellulare e i cambiamenti strutturali, che sono tutti ritenuti molto importanti per la formazione e il richiamo della memoria. Diversi metodi hanno esteso l’imaging in vivo all’ippocampo dorsale18,19,20,21,22. Preparazioni acute hanno permesso il monitoraggio dell’attività del neurone piramidale (PN) così come i loro dendriti e spine dendritiche per diverse ore20,22. Questo lasso di tempo temporale, tuttavia, non consente di studiare cambiamenti strutturali a lungo termine, che potrebbero essere alla base dell’apprendimento incrementale. I preparati cronici – in combinazione con micro-endoscopi23,24 o con obiettivi del microscopio standard a lunga distanza di lavoro (WD)21 – hanno permesso l’imaging ripetuto dell’ippocampo dorsale su diversi Settimane.
Qui, descriviamo una preparazione cronica che fornisce accesso ottico ricorrente al sottocampo CA1 dell’ippocampo dorsale dei topi viventi utilizzando una cannula di imaging permanentemente inserita. Questa preparazione consente l’accesso ripetuto al CA1 senza disturbi funzionali ed è adatta per l’imaging a due fotoni intravitali (2P) o ad epopeescenza ad ampio campo. Due esempi di imaging cronico del cervello profondo 2P nella CA1 dorsale dei topi vivi sono dettagliati: l’imaging longitudinale della struttura dendritica e la dinamica dendritica della colonna vertebrale e l’imaging longitudinale della plasticità articolata dall’attività. Vengono discussi i vantaggi e i limiti salienti della tecnica.
Qui, viene descritta una procedura per l’imaging 2P ripetuto del CA1 dorsale nei topi vivi. Dopo l’intervento chirurgico, il topo di solito si riprende entro 2 giorni. La procedura induce astrogliosi minima26,43. Emorragia ed edema che potrebbero seguire l’intervento chirurgico sono di solito ri-adsorbito entro 10 a 14 giorni. In generale, da 14 giorni dopo l’impianto in poi la preparazione è sufficientemente chiara per eseguire l’imaging intravitale. Il successo dell’intervento chirurgico non dipende dal lavoro in un ambiente sterile. Tuttavia, è fondamentale mantenere un alto livello di igiene, per evitare complicazioni dovute a infezioni associate alla chirurgia. Ciò si ottiene pulendo meticolosamente gli strumenti chirurgici prima e dopo l’intervento chirurgico e sterilizzandoli a caldo immediatamente prima di ogni utilizzo (passaggio 2.1.1). La cannula ottica viene conservata in un contenitore pulito e sterilizzato e sciacquata con salina sterile poco prima dell’impianto. Anche l’esecuzione di pratiche chirurgiche comuni di disinfezione delle mani e pulizia della stazione chirurgica è molto importante. La preparazione rimane stabile e consente l’imaging a risoluzione cellulare e subcellulare per diverse settimane26,35.
Passaggi critici, modifiche e risoluzione dei problemi.
È importante sbucciare la capsula esterna fino a quando le fibre più profonde sono esposte. La mancata esposizione dell’alveo potrebbe comportare l’incapacità di concentrarsi sul soma dei PN o in spine dendritiche di imaging a risoluzione ridotta, quando si utilizzano obiettivi commerciali con WD da 3 o 4 mm. A questo scopo, è utile ablate la neocorteccia molto lentamente utilizzando un ago di 0,9 mm di diametro e quindi passare a un ago di 0,3-0,5 mm di diametro (24-29 gauge) per un controllo più fine dell’aspirazione quando si rimuovono le fibre più dorsali. In alternativa, le pinze sottili possono essere utilizzate per rimuovere la corteccia rimanente dopo l’esposizione alle fibre36.
Sanguinamento durante l’intervento chirurgico può essere problematico, come il sangue ostruisce la vista. Si raccomanda l’attesa che il coagulo si formi e poi si risciacqua con salina per lavare via il sangue residuo. Se necessario, ripetere l’operazione.
Un aderente tra la cannula e la craniotomia aiuta ad aumentare la stabilità della preparazione mantenendo la cannula in posizione prima dell’applicazione del cemento, soprattutto se il bordo esterno della cannula è a filo con il cranio. Poiché le dimensioni del trapano trephine e della cannula sono abbinate, una vestibilità libera può sorgere a causa di irregolarità sul lato della cannula – che richiedono craniotomie leggermente più grandi per adattarsi (vedi passo 2.3.14) – o da una craniotomia irregolare. Eventuali irregolarità della cannula devono essere archiviate (passaggi 1.3 e 1.12) e la trefine deve essere tenuta perpendicolare al cranio fino al completamento della cranio (passaggio 2.3.12). La rimozione della trefina dal cranio prima del completamento della craniotomia può provocare craniotomie irregolari.
Limitazioni… Invasività e stabilità della preparazione.
È difficile valutare l’effetto dell’ablazione corticale in quanto è difficile definire con precisione le aree colpite direttamente e indirettamente. In generale, l’intervento chirurgico rimuove parte della corteccia parietale e parte della corteccia sensoriale arti visivi e posteriori21. La corteccia ablatata non si proietta direttamente nell’ippocampo e il tessuto ippocampale non viene né toccato né ferito. È importante sottolineare che l’impianto di una cannula di imaging non altera grossolanamente la funzione ippocampale e in particolare l’apprendimento dipendente dall’ippocampo21,36,37,38, 39. Tuttavia, sarebbe importante quantificare in che misura sia la cannula che la parte esterna dell’impianto (piastra del supporto della testa e tappo acrilico dentale) sono fattori di stress cronici valutando i livelli ematici del corticosterone e il peso della ghiandola surrenale rispetto topi non impiantati.
La preparazione rimane generalmente stabile da settimane a mesi26. A lungo termine, la crescita della pelle e delle ossa tende a sposto il cappuccio acrilico e ad aumentare l’instabilità della preparazione dell’imaging.
Limitazioni ottiche.
La microscopia 2P convenzionale consente di imaging fino a circa 1 mm di profondità nel tessuto neocorticale40,41. Coerentemente con questo, è possibile immagine dendriti e spine dendritiche situate nella SR (Figura 2D-F) o SLM36. Tuttavia, l’imaging attraverso una cannula pone limitazioni all’efficace NA. Per ottenere la massima risoluzione, il diametro e la profondità delle cannule di imaging devono essere abbinati all’imaging NA, poiché diametri più piccoli e profondità più lunghe imlimiteranno la luce di alti obiettivi NA. Ad esempio, quando si crea un obiettivo di immersione dell’acqua di 1,0 NA attraverso una cannula lunga 1,6 mm, è necessario un diametro interno di 3,65 mm per mantenere il NA completo. Tuttavia, utilizzando una cannula di questo diametro aumenterà la compressione sull’ippocampo e potrebbe influenzare la salute del tessuto, per questo motivo, usiamo una cannula con un diametro più piccolo. Quando si crea un obiettivo di immersione dell’acqua di 0,8 NA attraverso una cannula lunga 1,6 mm, un diametro interno di 2,5 mm sarebbe sufficiente per mantenere l’intero NA. Tuttavia, gli obiettivi di immersione dell’acqua 0,8 NA hanno un WD più corto (3 mm nel nostro caso), che può impedire di concentrarsi sul SP.
Questi calcoli si applicano al centro del campo visivo nella parte inferiore della cannula. Tuttavia, spostando il campo di imaging della vista lateralmente – più vicino ai bordi della cannula – o concentrandosi più in profondità nel tessuto – più lontano dalla superficie di vetro della cannula – diminuisce ulteriormente la NA efficace al piano focale e quindi riduce la risoluzione. Questo porterà a una risoluzione non omogenea tra i diversi volumi di tessuto immagine e può essere una preoccupazione per l’imaging quantitativo a risoluzione subcellulare, soprattutto quando si utilizzano tecniche di super-risoluzione come la microscopia 2P-STED42. Questi problemi sono meno importanti quando si esegue l’imaging a risoluzione cellulare.
Movimento dei tessuti.
Il movimento all’interno del tessuto – proveniente dalla respirazione e dal battito cardiaco negli animali anestesi – tende a diventare più grave con una maggiore distanza dalla cannula di imaging. Ciò è probabilmente dovuto al fatto che la cannula di imaging applica una pressione meccanica al cervello contrastando così parte del movimento nelle vicinanze della cannula (simile alle preparazioni neocorticali). Così, anche se l’imaging delle spine dendritiche è possibile in SR e SLM, nelle nostre mani, è più robusto dorsale alla SO fino a 200 m dalla superficie della cannula. Per compensare il movimento, utilizziamo scanner risonanti e una media offline. Diverse immagini (da 4 a 6 ripetizioni) vengono acquisite per piano di immagine di una z-stack alla velocità massima disponibile (30 fotogrammi/s). Tutte le ripetizioni per ogni z-plane vengono quindi deconvolved (utilizzando il software commerciale, AutoQuant), registrato (utilizzando ImageJ) e mediato in una singola immagine26. Per l’imaging di somata, il movimento è spesso trascurabile su anestesia35 e due medie sono spesso sufficienti per compensare gli artefatti di movimento.
Applicazioni future o indicazioni del metodo .
La preparazione può essere combinata con micro-endoscopi26,43. I microendoscopi sono sonde ottiche rigide che utilizzano microlenti indice di refrattivo a gradiente (GRIN) per guidare la luce da e verso il tessuto profondo18. L’uso di micro-endoscopi permette cannule di diametri più piccoli o addirittura nessuna cannula. Tuttavia, i micro-endoscopi commerciali sono meno ben corretti per le aberrazioni ottiche e hanno NA inferiore rispetto agli obiettivi commerciali. Le sonde di corrente raggiungono risoluzioni laterali e assiali di 0,6-1 m, 10-12 m, rispettivamente17,18,44. L’uso di micro-endoscopi consente anche la combinazione di questa preparazione con microscopi widefield integrati montati sulla testa45,46,47.
Il metodo si presta anche all’uso in topi non anestesizzati, ed è stato utilizzato per studiare l’attività cellulare utilizzando sensori Ca2 o nei topi svegli fissati alla testa21,37,48,49. In questi casi, a causa delle scale temporali veloci dei cambiamenti di fluorescenza, si consiglia di implementare la registrazione della linea50. È anche possibile adattare la preparazione per l’imaging di altre sottoregioni ippocampali come il giro dentato (DG)39,51,52. Combinando questa preparazione con eccitazione 3P53,54 con 1 MHz frequenza pulsato laser sintonizzato a 1400 nm, siamo stati in grado di immagine più in profondità nella formazione ippocampale raggiungendo lo strato molecolare, strato di cellule di granulo e il dell’DG (Figura 4) senza rimuovere la sovrapposizione CA1.
In conclusione, presentiamo un metodo che fornisce l’accesso ottico all’ippocampo dorsale e permette studi longitudinali e correlati delle dinamiche della struttura e dell’attività ippocampale. Questa tecnica estende le possibilità di analisi della funzione ippocampale in condizioni fisiologiche e patologiche.
The authors have nothing to disclose.
U. A. F. è sostenuta dalla fondazione Schram; C.-W. T. P. e W. G. sono supportati dalla Max Planck Society; L.Y. e R.Y. sono supportati dalla Max Planck Society e dal National Institute of Health (R01MH080047, 1DP1NS096787); A. C. è sostenuto da una sovvenzione del 7PQ del Consiglio europeo delle ricerche, dei programmi ERANET e I-CORE, dell’Ufficio Capo Scienziato del Ministero della Salute israeliano, del Ministero federale dell’istruzione e della ricerca, di Roberto e Renata Ruhman, di Bruno e Di Simone Lich, Nell e Leon Benoziyo Center for Neurological Diseases, l’Henry Chanoch Krenter Institute for Biomedical Imaging and Genomics, the Israel Science Foundation the Perlman Family, Adelis, Marc Besen, Pratt e Irving I. Moskowitz fondazioni; A. A. è supportato dalla Max Planck Society, dalla fondazione Schram e dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). Le immagini 3P sono state acquisite durante il Corso Avanzato sulle Tecniche di Neuroimaging presso il Max Planck Florida Institute for Neuroscience. Il corso avanzato sulle tecniche di neuroimaging è supportato dalla Max Planck Society, il programma Florida State Max Planck Scientific Fellowship e dal max Planck Florida Institute Corporation Partnership Program. Ringraziamo Thorlabs, Coherent e SpectraPhysics per aver fornito supporto e attrezzature per il sistema di imaging 2P / 3P durante il corso. Siamo anche grati a Henry Haeberle e Melissa Eberle per l’assistenza con il sistema durante il corso.
Professional drill/grinder IBS/E | Proxxon GmbH | 28481 | Pecision drill |
MICROMOT drill stand MB 200 | Proxxon GmbH | 28600 | Movable ruler table |
MICRO compound table KT 70 | Proxxon GmbH | 27100 | Movable ruler table |
Machine vice MS 4 | Proxxon GmbH | 28132 | Movable ruler table |
Stainless steel tube Ø 3,0 x 0,25 mm (Inner Ø 2,5 mm ) L = 500 mm | Sawade | R00303 | Stainless steel tube for the cannula metal ring |
Microscope Cover glass (4 mm round) | Engelbrecht Medizin and Labortechnik | Glass coverslips for the cannula glass | |
Schlusselfeilensatz 6-tgl. Im Blechetui | Hoffmann Group | 713750 160 | Manual files |
Präzisions-Nadelfeile Gesamtlänge 140 mm 4 | Hoffmann Group | 527230 4 | Manual files |
UV-Curing Optical Adhesives | Thorlabs | NOA81 | UV-curing adhesive |
UV Curing LED System, 365 nm | Thorlabs | CS2010 | UV-curing LED driver unit |
Stemi 305 | Zeiss | Stereoscope | |
Presto II | NSK-Nakanishi Germany | Z307015 | Dental drill |
Diamantbohrer FG (5 St.), Zylinder flach, 837-014 fein | MF Dental | F837.014.FG | Files for the dental drill |
Diamantbohrer FG (5 St.), Zylinder flach, 837-014 grob | MF Dental | G837.014.FG | Files for the dental drill |
Graefe Forceps – Straight / Serrated | Fine Science Tools | 11050-10 | Forceps for the surgery |
Burrs for Micro Drill | Fine Science Tools | 19008-05 | 0.5 mm width burr for the micro-drill |
Burrs for Micro Drill | Fine Science Tools | 19008-09 | 0.9 mm width burr for the micro-drill |
MicroMotor mit Handstück | DentaTec | MM11 | Micro-drill for the craniotomy |
Dumont #3 Forceps | Fine Science Tools | 11231-30 | Dumont forceps for the surgery |
Fine Scissors – ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 | Scissors for the surgery |
Trephine | MW Dental | 229-020 | Trephine drill – 3.0 mm diameter; for the micro-drill |
Stainless Steel Self-Tapping Bone Screws | Fine Science Tools | 19010-10 | 0.86 mm width bone screws |
Stereotaxic apparatus | Kopf | Stereotaxic apparatus | |
3-D-Gelenkarm | Hoffmann Group | 442114 | Stereotaxic arm and plate holder |
Aufnahme 2SM | Hoffmann Group | 442100 2SM | Stereotaxic arm and plate holder |
Hot Bead Sterilizers | Fine Science Tools | 18000-45 | Glass beads sterilizer |
Isofluran CP, Flasche 250 ml | Henry Schein VET GmbH | 798932 | Liquid isoflurane for anesthesia |
Harvard Apparatus Isoflurane Funnel-Fill Vaporizer | Harvard Apparatus GmbH | 34-1040 | Isoflurane vaporizer |
Lab Active Scavenger | Gropper Medizintechnik | UV17014 | Isoflurane scavenger system |
Metacam 0,5% Injektionslsg. (Hund / Katze), Flasche 20 ml | Henry Schein VET GmbH | 798566 | Meloxicam, anti-inflammatory |
Vetalgin 500 mg/ml | MSD Tiergesundheit | Vetalgin, pain killer | |
CMA 450 Temperature Controller | Hugo Sachs Elektronik – Harvard Apparatus GmbH | 8003770 | Heating blanket |
Bepanthen Augen- und Nasensalbe | Bayer AG | Ophtalmic ointment | |
KL 1500 LCD | Schott | Fiber optic light source | |
Xylocain Pumpspray | AstraZeneca GmbH | Lidocain, local anesthetic | |
Absorption Triangles – Unmounted | Fine Science Tools | 18105-03 | Absorption triangles for the surgery |
Parkell C&B Metabond clear powder L | Hofmeester dental | 013622 | Quick adhesive cement |
Parkell C&B Metabond Quick Base B | Hofmeester dental | 013621 | Quick adhesive cement |
Parkell C&B Metabond Universal Catalyst C | Hofmeester dental | 013620 | Quick adhesive cement |
Adjustable Precision Applicator Brushes | Parkell | S379 | Precision applicators for the surgery |
Blunt needles 0.9×23 mm | Dentina | 0441324 | Blunt needles |
Blunt needles 0.5×42 mm | Dentina | 0452155 | Blunt needles |
Blunt needles 0.3×23 mm | Dentina | 0553532 | Blunt needles |
Kallocryl A/C | Speiko | 1615 | Acrylic liquid component |
Kallocryl | Speiko | 1609 | Acrylic powder |
Hydrofilm transparent roll | Hartmann | Adhesive film | |
Head plates | Custom made | 30 mm x 10 mm size; 8 mm diameter hole, titanium | |
Head plate clamp | Custom made | Head plate holder | |
Pedestal post holders | Thorlabs | PH20E/M | Head plate holder |
Stainless steel post | Thorlabs | TR30/M | Head plate holder |
Stainless steel post | Thorlabs | TR75/M | Head plate holder |
Stainless steel post | Thorlabs | TR150/M | Head plate holder |
Post connector clamps | Custom made | Head plate holder | |
Aluminum Breadboard, 300 mm x 450 mm x 12.7 mm, M6 Taps | Thorlabs | MB3045/M | Microscope stage |
7" x 4" Lab Jack | Thorlabs | L490/M | Microscope stage |
Low profile face mask small mice | Emka Technologies | VetFlo-0801 | Anesthesia facemask holder |
RS4000 Tuned Damped Top Performance Optical Table | Newport | Floating table | |
S-2000A Top Performance Pneumatic Vibration Isolators with Automatic Re-Leveling | Newport | Floating table | |
Power Meter Model 1918-R | Newport | Power meter | |
X-Cite 120Q | Excelitas Technologies | Fluorescence lamp | |
Two-photon microscope | Bruker | Ultima IV | Two-photon microscopes |
Two-photon microscope | Thorlabs | Bergamo | Two-photon microscopes |
Plan N 4x/0.10 ∞/-/FN22 | Olympus | Objectives | |
Plan N 10x/0.25 ∞/-/FN22 | Olympus | Objectives | |
LMPlan FLN 20x/0.40 ∞/-/FN26.5 | Olympus | Objectives | |
XLPlan N 25x/1.00 SVMP ∞/0-0.23/FN18 | Olympus | Objectives | |
Ultafast tunable laser for 2P excitation | Spectraphysics | Mai Tai Deep See | Excitaiton lasers |
Ultafast tunable laser for 2P excitation | Spectraphysics | InSight DS+ Dual beam | Excitaiton lasers |
Ultafast tunable laser for 3P excitation | Coherent | Monaco | Excitaiton lasers |