피부에 있는 유전으로 표를 붙인 기자 세포의 Vivo 2 색 2-광자 화상 진찰에서
Summary
형태학적 변화는 활성화 다음 면역 반응 섬유 아세포 세포에서 발생하고 세포 모집에 변경을 촉진. 유전자 조작섬유아세포 특이적 단백질 1(FSP1)-cre와 함께 2광자 이미징을 활용; tdTomato floxed-stop-floxed (TB/TB) 마우스 라인과 녹색 형광 태그 lipopolysaccharide-FITC, 우리는 진피 섬유아세포와 생체 내 형태학적 변화에 있는 lipopolysaccharide의 고도로 특정 한 섭취를 설명할 수 있습니다.
Abstract
섬유아세포는 활성화 시 형태를 변화시키는 중간엽 세포이며, 궁극적으로 그들이 위치한 조직의 미세 환경에 영향을 미칩니다. 전통적인 화상 진찰 기술은 고정된 조직에 있는 단백질 상호 작용 그리고 형태학을 확인하는 에서 유용하더라도, 그(것)들은 세포가 단백질을 결합하고 장악할 수 있는 얼마나 빨리에 관해서는 통찰력을 줄 수 없습니다, 그리고 일단 활성화된 그들의 형태가 어떻게 변경되는지 Vivo. 본 연구에서, 우리는 2 개의 중요한 질문을 합니다: 1) 톨-유사 수용체-4 (TLR4) 및 리포폴리사카라이드 (LPS) 상호 작용을 통해 섬유아세포 활성화의 시간 과정은 무엇이며 2) 이 세포는 한 번 활성화되면 어떻게 행동합니까? 2 광자 화상 진찰을 사용하여, 우리는 그것의 동체 수용체, TLR4에 결합하는 LPS-FITC의 기능을 평가하는 새로운 기술을 개발했습니다, 유전 기자 마우스 라인에 있는 말초 섬유아세포에 표현된; FSP1cre; tdTomato록스 스톱 록스 생체 내. 이 독특한 접근을 허용하는 이 독특한 접근은 연구원이 단백질이 세포 행동을 바꿀 수 있는 방법 이해에 있는 세분성의 증가한 수준을 가질 수 있게 하는 살아있는 세포와 상호 작용하는 단백질의 심층적인, 시간 경과 비디오 및/또는 사진을 만들 수 있습니다.
Introduction
리포폴리사카라이드(LPS)는 그람 음성 박테리아의 외막에서 발견되는 내독소1. LPS는 톨형 수용체 4(TLR4)/CD14/MD2 수용체 복합체 2에대해 높은 결합 친화도를 가지는다. TLR4는 광범위한 면역 세포, 중간엽 세포 및 감각 뉴런의 서브세트3,4,5의외부막에서 흔하게 발견되는 패턴 인식 수용체이다. 면역 세포에 발현되는 TLR4의 활성화는 MyD88 의존적이고 독립적인 제2 메신저 시스템으로 이어지며, 세포의 핵으로의 핵인자 카파 베타(NFθB) 전좌로 끝납니다. 이것은 프로토티면역세포가 인터류킨(IL)-1β, IL-6 및 TNF-α6과 같은 염증성 사이토카인을생성하고 방출하게 한다. 그러나, 다른 세포 유형이 TLR4 자극에 반응하는 방식은 명확하지 않다. 섬유아세포는 암 및 낭포성 섬유증과 같은 광범위한 병리학에 연루되어 있으며 최근에는 단핵구 화학적 매력및 염증 촉진 7,8,9. 우리 실험실은 급성 및 만성 통증의 발달에 섬유 아세포의 역할에 관심이, 초기 증거는 섬유 아세포에 의해 발표 된 요인 (매트릭스 금속 종로 단백질 효소 (MMPs), 금속 종단 단백질 효소의 조직 억제제 (TIMPs), 및 섬유 아세포 성장 인자 (FGFs))는 신경 병성 통증10에관여합니다.
세포의 활성화 상태는 다음과 같은 다양한 인자에 의해 결정될 수 있다: 즉각적인 초기 유전자의 유도, 변경된 단백질 발현, 세포 증식, 및 형태학적 변화11,12,13. 세포의 활성화가 병리학에 기여하는 방법에 관하여 우리가 가질 수 있는 질문에 대답하기 위하여 존재하는 많은 기술이 있습니다, 그러나 그(것)들은 모두 그들의 한계가 있습니다. 프로토타입 면역조직화학은 형광성 으로 태그가 부착된 항체를 사용하여 고정 된 조직에 관심있는 단백질을 라벨링하며, 이는 비특이적일 수 있으며 종종 유익한 결과를 산출하기 전에 상당한 문제 해결이 필요할 수 있습니다14. 서양 블로팅은 사후 조직에서 단백질 발현 수준을 비교할 때 유용한 기술입니다. 그러나, 조직학 분대는 이 기술에 결여되고 연구원은 형태학15에있는 어떤 변경든지 확인할 수 없습니다. RNA-Seq는 많은 경우에 통찰력있는 데이터를 산출하는 견본에 있는 메신저 RNA의 존재를 정량화하는 것을 허용합니다; 그러나, 전사와 번역 사이의 간격은 자극16후에 시간적 분해를 갖기 어렵게 만든다. 공초점 화상 진찰은 조직의 단면에 존재하는 단백질의 발현 및 공동 국소화를 결정하는 데 유용하다17. 종종 이것은 조직 샘플 전체를 대표하지 않습니다. 대조적으로, 다중 광자 현미경은 사용자가 포괄적인 3차원 표현18을만드는 견본에 대략 1 mm 깊이를 심층으로 심을 수 있습니다. 따라서, 우리는 생체 내, 2 광자 이미징 준비에 초점을 선택, 이러한 실험에서 수집 된 데이터는 살아있는 조직의 높은 플라스틱 및 상호 연결된 미세 환경에 더 직접적으로 관련되어 있기 때문에.
생체 내에서 단백질 수용체 상호작용을 연구하는 장점은 세포가 사후 조직 추출의 유해하고 예측할 수 없는 영향 없이 그들의 모국 환경에서실시간으로 자극에 반응하는 방법을 명확하게 포착할 수 있다는 것이다 19. 또한, 종방향 연구는 활성화로 인해 발생할 수 있는 세포 가소성과 프라이밍을 평가하기 위해 수행될 수 있다. 2 광자 이미징을 사용하여 외부 자극이 적용될 때 존재하는 미세 환경의 무결성을 보존합니다. 이 프로토콜은 생체 내에서 몇 시간 동안 형광 태그가 붙은 LPS의 말초 주입 후 섬유아세포에서 분자의 섭취를 식별하는 방법과 섬유아세포 활성화에서 TLR4의 역할을 제공한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
틀림없이 생체 내 2 광자 이미징의 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다 : 1) 다중 광자 설정 및 실험 요구에 적합한 유전 기자 마우스 및 형광 태그 단백질을 선택21,22; 2) 조직(23)에 있는 세포의 집단의 정확한 표현을갖도록 정확한 초점 평면을 이미징; 3) 부적절하게 고정된 동물(24)으로인한 이동 최소화; 4) 정량적으?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 교부금 NS096030(MDB)에 의해 지원됩니다. 우리는 또한 이미징 코어 매니저 Ved Prakash에 감사드립니다. 또한 UT 달라스의 올림푸스 디스커버리 센터/이미징 코어 시설에 장비와 지원을 제공한 것에 대해 감사드립니다.
Materials
| 10x PBS, 4 L | Fisherbrand | BP3994 | |
| 700 Series MICROLITER Syringes, Hamilton, Model 705 LT Syringe | Hamilton | 80501 | |
| BD Precision Glide Needle 30G | VWR | 305106 | |
| Blue Pad | Fisherbrand | 1420665 | |
| Filter Cube: Green/Red (BP 495-540 DM570 BP 575-645) | Olympus | FV30-FGR | |
| Isoflurane, USP 250 mL | Vedco | 50989-150-15 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia Coli O111:B4 – FITC conjugate | Sigma-Aldrich | F3665-1MG | |
| Main scanner laser: Spectra Physics INSIGHT DS+ -OL pulsed IR LASER, tunable from 680 nm to 1300 nm, 120 fs pulse width at specimen plane | Spectra Physics | ||
| Micro Centrifuge Tubes, 1.5 mL | VWR | 20170-333 | |
| Multiphoton Microscope: Olympus MPE-RS TWIN | Olympus | MPE-RS TWIN | |
| Objective: Ultra 25x MPE water-immersion objective 1.05 NA, 2 mm WD | Olympus | XLPLN25XWMP2 | |
| Personal Lubricant Jelly (Gel) | equate | ZH727 2E F1 | |
| SGM-4 Stereotaxic Apparatus | Narishige | 16030 | |
| SomnoSuite Low-Flow Anesthesia System | Kent Scientific Corporation | SS-01 | |
| Stimulation laser: Olympus-specific SPECTRA PHYSICS MAI TAI HP DEEP SEE-OL pulsed IR LASER, tunable from 690 nm to 1040 nm, 100 fs pulse width at specimen plane | Spectra Physics |
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