In vivo tweekleurige 2-Fobe beeldvorming van genetisch gelabelde reporter cellen in de huid
Summary
Morfologische veranderingen optreden in immuun responsieve fibroblast cellen na activering en het bevorderen van veranderingen in cellulaire werving. Gebruik makend van 2-Photon Imaging in combinatie met een genetisch gemanipuleerde fibroblast-specifieke proteïne 1 (FSP1)-CRE; tdTomato floxed-stop-floxed (TB/TB) muis lijn en groene fluorescently gelabeld lipopolysaccharide-FITC, we kunnen zeer specifieke opname van lipopolysaccharide in dermale fibroblasten en morfologische veranderingen in vivo illustreren.
Abstract
Fibroblasten zijn mesenchymale cellen die hun morfologie veranderen bij activering, wat uiteindelijk invloed heeft op de micro omgeving van het weefsel waarin ze zich bevinden. Hoewel traditionele beeldvormingstechnieken nuttig zijn bij het identificeren van eiwit interacties en morfologie in vast weefsel, zijn ze niet in staat om inzicht te geven in hoe snel cellen kunnen binden en opname van eiwitten, en eenmaal geactiveerd hoe hun morfologie veranderingen in Vivo. In de huidige studie, vragen we 2 belangrijke vragen: 1) wat is de tijd-loop van fibroblast activering via Toll-achtige receptor-4 (TLR4) en lipopolysaccharide (LPS) interactie en 2) Hoe gedragen deze cellen zich eenmaal geactiveerd? Met behulp van 2-Photon Imaging hebben we een nieuwe techniek ontwikkeld om het vermogen van LPS-FITC te beoordelen om te binden aan zijn verwant receptor, TLR4, uitgedrukt op perifere fibroblasten in de genetische reporter muis lijn; FSP1cre; tdTomatoLox-stop-Lox in vivo. Deze unieke aanpak stelt onderzoekers in staat om diepgaande, timelapse-Video’s en/of Foto’s van eiwitten te creëren die interactie vertonen met levende cellen, waardoor men een groter granulariteit kan hebben in het begrijpen hoe eiwitten cellulair gedrag kunnen veranderen.
Introduction
Lipopolysaccharide (LPS) is een endotoxine gevonden in het buitenste membraan van gram-negatieve bacteriën1. LPS heeft een hoge bindingsaffiniteit voor de tol-achtige receptor 4 (TLR4)/CD14/MD2 receptor complex2. TLR4 is een patroon herkennings receptor die vaak voorkomt op het buitenste membraan van een breed scala aan immuuncellen, mesenchymale cellen en een subset van sensorische neuronen3,4,5. Activering van TLR4 uitgedrukt op immuuncellen leidt tot MyD88 afhankelijke en onafhankelijke tweede Messenger systemen, eindigend met Nuclear-factor Kappa Beta (NFκB) translocatie naar de kern van de cel. Dit zorgt ervoor dat de prototypische immuuncel pro-inflammatoire cytokines produceert en vrijgeeft, zoals Interleukine (IL) -1 β, IL-6 en TNF-α6. Echter, hoe andere celtypes reageren op TLR4 stimulatie is niet zo duidelijk. Fibroblasten zijn betrokken geweest bij een breed scala aan pathologieën zoals kanker en Cystic fibrose en hebben onlangs aangetoond dat het een rol speelt monocyt chemo-aantrekkingskracht en het bevorderen van ontstekingen7,8,9. Ons lab is geïnteresseerd in de rol van fibroblasten bij de ontwikkeling van acute en chronische pijn, als vroeg bewijs suggereert dat factoren vrijkomen door fibroblasten (matrix matrixmetalloproteïnases (mmps), weefsel remmer van matrixmetalloproteïnases (timps), en fibroblast groeifactoren (FGFs)) zijn betrokken bij neuropathische pijn10.
De activerings toestanden van cellen kunnen worden bepaald door een verscheidenheid aan factoren, waaronder: inductie van direct-vroege genen, veranderde eiwit expressie, celproliferatie en morfologische veranderingen11,12,13. Er zijn veel technieken die bestaan om vragen te beantwoorden over hoe activering van cellen bijdraagt aan pathologieën, maar ze hebben allemaal hun beperkingen. Prototypische immunohistochemie gebruikt fluorescently gelabelde antilichamen tegen etiket eiwitten van belang in vast weefsel, die mogelijk onspecifiek zijn en vaak aanzienlijke probleemoplossing vereisen voordat ze vruchtbare resultaten opleveren14. Western blotting is een nuttige techniek bij het vergelijken van niveaus van eiwit expressie in postmortemweefsel; echter, de histologische component ontbreekt in deze techniek en onderzoekers zijn niet in staat om veranderingen in de morfologie te identificeren15. RNA-SEQ stelt ons in staat om de aanwezigheid van Messenger RNA te kwantificeren in een monster dat in veel gevallen inzichtelijke gegevens oplevert; echter, de kloof tussen transcriptie en vertaling maakt het moeilijk om de temporele resolutie na een stimulus16. Confocale beeldvorming is nuttig bij het bepalen van de expressie en de co-lokalisatie van eiwitten die bestaan in een dwarsdoorsnede van weefsels17. Vaak is dit niet representatief voor het geheel van het weefselmonster. Daarentegen kunnen gebruikers met multiphoton-microscopen ongeveer 1 mm diep in een steekproef afbeellen, waardoor een uitgebreide driedimensionale representatie18ontstaat. Daarom kiezen we ervoor om zich te concentreren op in vivo, 2-Photon Imaging Preps, omdat de gegevens die worden verzameld uit deze experimenten meer rechtstreeks relatable zijn aan de zeer plastic en onderling verbonden micro-omgeving van levend weefsel.
Een voordeel van het bestuderen van eiwit-receptor interacties in vivo is dat we duidelijk kunnen vastleggen hoe cellen reageren op een stimulus, real-time, in hun eigen omgeving zonder de schadelijke en onvoorspelbare invloed van postmortemingsweefsel extractie19. Bovendien, longitudinale studies kunnen worden uitgevoerd om te beoordelen van de cellulaire plasticiteit en priming die kunnen optreden vanwege activering. Met behulp van 2-Photon Imaging, behouden we de integriteit van de micro omgeving aanwezig wanneer een externe stimulans wordt toegepast. Dit protocol biedt een manier om de opname van moleculen in fibroblasten te identificeren na perifere injectie van fluorescendig gelabelde LPS in de loop van enkele uren in vivo en de rol van TLR4 bij de activering van fibroblast.
Protocol
Representative Results
Discussion
Misschien wel de belangrijkste stappen van in vivo 2-Photon Imaging zijn: 1) het kiezen van de juiste genetische reporter muis en fluorescently gelabeld eiwit voor de multi-photon Setup en experimentele behoeften21,22; 2) beeldvorming van het juiste focale vlak om een nauwkeurige weergave van de populatie van cellen in het weefsel23; 3) minimaliseren van de beweging als gevolg van een onjuist geïmmobiliseerd dier24…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk wordt ondersteund door de subsidie NS096030 (MDB). We willen ook de Imaging Core Manager ved Prakash bedanken. We willen ook Olympus Discovery Center/Imaging Core Facility van UT Dallas bedanken voor het leveren van apparatuur en ondersteuning
Materials
| 10x PBS, 4 L | Fisherbrand | BP3994 | |
| 700 Series MICROLITER Syringes, Hamilton, Model 705 LT Syringe | Hamilton | 80501 | |
| BD Precision Glide Needle 30G | VWR | 305106 | |
| Blue Pad | Fisherbrand | 1420665 | |
| Filter Cube: Green/Red (BP 495-540 DM570 BP 575-645) | Olympus | FV30-FGR | |
| Isoflurane, USP 250 mL | Vedco | 50989-150-15 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia Coli O111:B4 – FITC conjugate | Sigma-Aldrich | F3665-1MG | |
| Main scanner laser: Spectra Physics INSIGHT DS+ -OL pulsed IR LASER, tunable from 680 nm to 1300 nm, 120 fs pulse width at specimen plane | Spectra Physics | ||
| Micro Centrifuge Tubes, 1.5 mL | VWR | 20170-333 | |
| Multiphoton Microscope: Olympus MPE-RS TWIN | Olympus | MPE-RS TWIN | |
| Objective: Ultra 25x MPE water-immersion objective 1.05 NA, 2 mm WD | Olympus | XLPLN25XWMP2 | |
| Personal Lubricant Jelly (Gel) | equate | ZH727 2E F1 | |
| SGM-4 Stereotaxic Apparatus | Narishige | 16030 | |
| SomnoSuite Low-Flow Anesthesia System | Kent Scientific Corporation | SS-01 | |
| Stimulation laser: Olympus-specific SPECTRA PHYSICS MAI TAI HP DEEP SEE-OL pulsed IR LASER, tunable from 690 nm to 1040 nm, 100 fs pulse width at specimen plane | Spectra Physics |
References
- Ulevitch, R. J., Tobias, P. S. Recognition of gram-negative bacteria and endotoxin by the innate immune system. Current Opinion in Immunology. 11 (1), 19-22 (1999).
- Poltorak, A., et al. Defective LPS signaling in C3H/HeJ and C57BL/10ScCr mice: mutations in Tlr4 gene. Science. 282 (5396), 2085-2088 (1998).
- Bhattacharyya, S., Midwood, K. S., Yin, H., Varga, J. Toll-Like Receptor-4 Signaling Drives Persistent Fibroblast Activation and Prevents Fibrosis Resolution in Scleroderma. Advances in Wound Care. 6 (10), 356-369 (2017).
- Wadachi, R., Hargreaves, K. M. Trigeminal nociceptors express TLR-4 and CD14: a mechanism for pain due to infection. Journal of Dental Research. 85 (1), 49-53 (2006).
- Janssens, S., Beyaert, R. Role of Toll-like receptors in pathogen recognition. Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 637-646 (2003).
- Barratt, D. T., Klepstad, P., Dale, O., Kaasa, S., Somogyi, A. A. Innate Immune Signalling Genetics of Pain, Cognitive Dysfunction and Sickness Symptoms in Cancer Pain Patients Treated with Transdermal Fentanyl. PLoS One. 10 (9), 0137179 (2015).
- Paish, H. L., et al. Fibroblasts Promote Inflammation and Pain via IL-1alpha Induction of the Monocyte Chemoattractant Chemokine (C-C Motif) Ligand 2. American Journal of Pathology. 188 (3), 696-714 (2018).
- Turner, C. A., Eren-Kocak, E., Inui, E. G., Watson, S. J., Akil, H. Dysregulated fibroblast growth factor (FGF) signaling in neurological and psychiatric disorders. Seminars in Cell and Developmental Biology. 53, 136-143 (2016).
- Rommens, J. M., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping. Science. 245 (4922), 1059-1065 (1989).
- Madiai, F., et al. Anti-fibroblast growth factor-2 antibodies attenuate mechanical allodynia in a rat model of neuropathic pain. Journal of Molecular Neuroscience. 27 (3), 315-324 (2005).
- Hoffman, G. E., Smith, M. S., Verbalis, J. G. c-Fos and related immediate early gene products as markers of activity in neuroendocrine systems. Frontiers in Neuroendocrinology. 14 (3), 173-213 (1993).
- Ieni, A., et al. Morphological and Cellular Features of Innate Immune Reaction in Helicobacter pylori Gastritis: A Brief Review. International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), (2016).
- Brennen, W. N., Isaacs, J. T., Denmeade, S. R. Rationale behind targeting fibroblast activation protein-expressing carcinoma-associated fibroblasts as a novel chemotherapeutic strategy. Molecular Cancer Therapeutics. 11 (2), 257-266 (2012).
- Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomark Insights. 5, 9-20 (2010).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medicine & Science. 4 (9), 429-434 (2012).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
- Jonkman, J., Brown, C. M. Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques. Journal of Biomolecular Techniques. 26 (2), 54-65 (2015).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. American Journal of Pathology. 161 (6), 1961-1971 (2002).
- Tsutsumi, R., et al. PGE2 signaling through the EP4 receptor on fibroblasts upregulates RANKL and stimulates osteolysis. Journal of Bone and Mineral Research. 24 (10), 1753-1762 (2009).
- Golzio, M., Rols, M. P., Gabriel, B., Teissie, J. Optical imaging of in vivo gene expression: a critical assessment of the methodology and associated technologies. Gene Therapy. 11, 85-91 (2004).
- Victora, G. D., et al. Germinal center dynamics revealed by multiphoton microscopy with a photoactivatable fluorescent reporter. Cell. 143 (4), 592-605 (2010).
- Duemani Reddy, G., Kelleher, K., Fink, R., Saggau, P. Three-dimensional random access multiphoton microscopy for functional imaging of neuronal activity. Nature Neuroscience. 11 (6), 713-720 (2008).
- Kolesnikov, M., Farache, J., Shakhar, G. Intravital two-photon imaging of the gastrointestinal tract. Journal of Immunological Methods. 421, 73-80 (2015).
- Ruthazer, E. S., Cline, H. T. Multiphoton imaging of neurons in living tissue: Acquisition and analysis of time-lapse morphological data. Real-Time Imaging. 8 (3), 175-188 (2002).
- Liu, K., et al. In vivo Analysis of Dendritic Cell Development and Homeostasis. Science. 324 (5925), 392-397 (2009).
- Barber, P. R., et al. Multiphoton time-domain fluorescence lifetime imaging microscopy: practical application to protein-protein interactions using global analysis. Journal of the Royal Society Interface. 6, 93-105 (2009).
- Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (4), 723-742 (2011).
- Gaigalas, A. K., et al. The Development of Fluorescence Intensity Standards. Journal of Research of the National Institute of Standards and Technology. 106 (2), 381-389 (2001).
- Tian, T., Wang, Y., Wang, H., Zhu, Z., Xiao, Z. Visualizing of the cellular uptake and intracellular trafficking of exosomes by live-cell microscopy. Journal of Cellular Biochemistry. 111 (2), 488-496 (2010).
- Buckers, J., Wildanger, D., Vicidomini, G., Kastrup, L., Hell, S. W. Simultaneous multi-lifetime multi-color STED imaging for colocalization analyses. Optics Express. 19 (4), 3130-3143 (2011).
- Zheng, J. H., Walters, E. T., Song, X. J. Dissociation of dorsal root ganglion neurons induces hyperexcitability that is maintained by increased responsiveness to cAMP and cGMP. Journal of Neurophysiology. 97 (1), 15-25 (2007).
- Ingaramo, M., York, A. G., Andrade, E. J., Rainey, K., Patterson, G. H. Two-photon-like microscopy with orders-of-magnitude lower illumination intensity via two-step fluorescence. Nature Communications. 6, 8184 (2015).
- Makale, M., et al. Extended-working-distance multiphoton micromanipulation microscope for deep-penetration imaging in live mice and tissue. Journal of Biomedical Optics. 14 (2), 024032 (2009).
