İn vivo Iki renkli 2-foton görüntüleme genetiği etiketlenmiş Reporter hücrelerinin cilt içinde
Summary
Morfolojik değişiklikler, aktivasyon sonrasında bağışıklık duyarlı fibroblast hücrelerinde ortaya çıkar ve hücresel işe alma değişiklikleri teşvik. Genetik olarak tasarlanan fibroblast spesifik protein 1 (FSP1)-CRE ile birlikte 2-foton görüntülemenin kullanılması; tdtomato floxed-dur-floxed (TB/TB) fare hattı ve yeşil floresan etiketlenmiş lipopolisakkarid-fitc, biz dermal fibroblastlar ve morfolojik değişiklikler içinde lipopolisakkarid son derece spesifik alımı göstermek olabilir vivo.
Abstract
Fibroblastlar, aktivasyon üzerine morfolojisini değiştirecek olan mezenkimal hücrelerdir, sonuçta bulunan dokuların mikroortamını etkiliyor. Geleneksel görüntüleme teknikleri sabit dokuda protein etkileşimlerini ve morfolojisi tanımlamada yararlı olmasına rağmen, hücrelerin nasıl hızlı bir şekilde proteinleri bağlayabilir ve elde edebildikleri hakkında bilgi vermek mümkün değildir ve bir kez nasıl onların morfoloji değişiklikleri aktive Vivo. Bu çalışmada 2 büyük soru soruyoruz: 1) ne zaman-fibroblast aktivasyonunun Toll-gibi reseptör-4 (TLR4) ve lipopolisakkarid (LPS) etkileşimi ve 2) ile zaman-ders ne kadar bu hücreler bir kez aktive davranır? 2-foton görüntüleme kullanarak, biz, onun bilat reseptör bağlamak için LPS-FITC yeteneğini değerlendirmek için bir yeni teknik geliştirdik TLR4, genetik muhabir fare hattında periferik fibroblastlar üzerinde ifade; FSP1cre; tdTomatoLOX-dur-LOX in vivo. Bu benzersiz yaklaşım, araştırmacıların derinlemesine, zaman atlamalı videolar ve/veya proteinlerin resimleri, birinin proteinleri hücresel davranışı nasıl değiştireceğinizi anlamada daha fazla ayrıntı düzeyine sahip olmasını sağlayan canlı hücrelerle etkileşimde bulunmasına olanak tanır.
Introduction
Lipopolysaccharide (LPS), gram-negatif bakterilerin dış membranında bulunan bir endotoksindir1. LPS, Toll benzeri reseptör 4 (TLR4)/CD14/MD2 reseptör kompleksi2için yüksek bağlayıcı bir benzeşimi vardır. TLR4 yaygın bağışıklık hücreleri, mezenkimal hücreler, ve duyusal nöronların bir alt kümesini dış membran üzerinde bulunan bir desen tanıma reseptörü3,4,5. Bağışıklık hücrelerinde ifade edilen TLR4 aktivasyonu, MyD88-bağımlı ve bağımsız ikinci haberci sistemlerine yol açar, nükleer faktörlü Kappa Beta ile biten (NfκB) hücrenin çekirdeğine translokasyon. Bu, prototiplik bağışıklık hücresinin Interleukin (IL) -1 β, IL-6 ve TNF-α6gibi Pro-inflamatuar sitokinleri üretmesine ve serbest bırakmasına neden olur. Ancak, nasıl diğer hücre türleri TLR4 stimülasyon yanıt olarak açık değildir. Fibroblastlar, kanserler ve kistik fibrozis gibi çok çeşitli patolojilerde karışmıştır ve son zamanlarda monoksit kemo-cazibe ve inflamasyonu teşvik eden bir rol oynarken gösterilmiştir7,8,9. Laboratuvarımız, akut ve kronik ağrının gelişiminde fibroblastların rolü ile ilgileniyor, erken kanıtlar fibroblastlar (Matrix metalloproteinazların (mmps), metalloproteinazlar (timps) ve fibroblast doku inhibitörü tarafından yayımlanan faktörlerin olduğunu göstermektedir büyüme faktörleri (FGFs)) nöropatik ağrıyla ilgili10.
Hücrelerin aktivasyonu durumları çeşitli faktörlerle tespit edilebilir: hemen erken genler indüksiyon, değiştirilmiş protein ifadesi, hücre proliferasyonu, ve morfolojik değişiklikler11,12,13. Hücrelerin aktivasyonunun patolojilere nasıl katkı sağladığı konusunda sahip olduğumuz sorulara cevap vermek için mevcut olan birçok teknik vardır, ancak hepsinin sınırlamaları vardır. Prototip immünhistokimya, sabit dokuda ilgi proteinlerini etiketlemek için floresan olarak etiketlenmiş antikorları kullanır ve bu da spesifik olmayan ve sıklıkla verimli sonuçlar14‘ e girmeden önce önemli sorun giderme gerektirebilir. Western blot Post-mortem doku protein ifade düzeylerini karşılaştırarak yararlı bir tekniktir; Ancak, histolojik bileşen bu tekniğin eksikliği ve araştırmacılar morfoloji herhangi bir değişiklik belirleyemiyor15. RNA-seq, birçok durumda anlayışlı veri veren bir örnekteki haberci RNA ‘nın varlığını ölçmek için bize izin verir; Ancak, transkripsiyon ve çeviri arasındaki boşluk, bir uyarıcı16‘ dan sonra temporal çözünürlüğe sahip olmayı zorlaştırır. Konfokal görüntüleme, dokuların bir kesitinde mevcut olan proteinlerin ifade ve ortak lokalizasyonu belirlenmesinde yararlıdır17. Genellikle, bu doku örneğinin tamamını temsilcisi değildir. Buna karşılık, multifoton mikroskoplar, kullanıcılara yaklaşık olarak 1 mm derinlikte bir numune içine görüntü sağlar, kapsamlı bir üç boyutlu gösterimi18oluşturur. Bu nedenle, Bu deneylerden toplanan veriler, canlı dokuların son derece plastik ve birbiriyle bağlantılı mikro ortamına daha doğrudan bağlandığı için, in vivo, 2-foton görüntüleme preps üzerine odaklanmayı tercih ediyoruz.
İçinde vivo protein reseptör etkileşimleri okuyan bir avantajı biz açıkça hücrelerin bir uyarıcı, gerçek zamanlı, kendi yerel ortamında Post-mortem doku ekstraksiyon19zararlı ve öngörülemeyen etkisi olmadan yanıt nasıl yakalayabiliriz. Ayrıca, hücresel plastisite ve aktivasyonu nedeniyle oluşabilecek astar değerlendirmek için uzunlamasına çalışmalar yapılabilir. 2-foton görüntüleme kullanarak, harici bir uyarıcı uygulandığında mevcut mikroortamın bütünlüğünü koruyacağız. Bu protokol, birkaç saat in vivo boyunca floresan etiketli LPS periferik enjeksiyon ve fibroblast aktivasyonu TLR4 rolü aşağıdaki fibroblastlar moleküllerin alımı belirlemek için bir yol sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
In vivo 2-foton görüntülemenin en önemli adımları şunlardır: 1) doğru genetik muhabirin fareyi seçme ve çoklu foton kurulumu ve deneysel ihtiyaçlar için floresan etiketli protein21,22; 2) doku23hücrelerin nüfusun doğru bir temsili olması için doğru odak düzlem görüntüleme; 3) yanlış immobilize hayvan nedeniyle hareketi en aza indirmek24; ve 4) verileri analiz etmek için zaman seçilmesi nit…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu iş Grant NS096030 (MDB) tarafından desteklenir. Biz de görüntüleme çekirdek Yöneticisi ved Prakash teşekkür etmek istiyorum. Biz de ekipman ve destek sağlamak için UT Dallas Olympus Discovery Center/Imaging Core tesisi teşekkür etmek istiyorum
Materials
| 10x PBS, 4 L | Fisherbrand | BP3994 | |
| 700 Series MICROLITER Syringes, Hamilton, Model 705 LT Syringe | Hamilton | 80501 | |
| BD Precision Glide Needle 30G | VWR | 305106 | |
| Blue Pad | Fisherbrand | 1420665 | |
| Filter Cube: Green/Red (BP 495-540 DM570 BP 575-645) | Olympus | FV30-FGR | |
| Isoflurane, USP 250 mL | Vedco | 50989-150-15 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia Coli O111:B4 – FITC conjugate | Sigma-Aldrich | F3665-1MG | |
| Main scanner laser: Spectra Physics INSIGHT DS+ -OL pulsed IR LASER, tunable from 680 nm to 1300 nm, 120 fs pulse width at specimen plane | Spectra Physics | ||
| Micro Centrifuge Tubes, 1.5 mL | VWR | 20170-333 | |
| Multiphoton Microscope: Olympus MPE-RS TWIN | Olympus | MPE-RS TWIN | |
| Objective: Ultra 25x MPE water-immersion objective 1.05 NA, 2 mm WD | Olympus | XLPLN25XWMP2 | |
| Personal Lubricant Jelly (Gel) | equate | ZH727 2E F1 | |
| SGM-4 Stereotaxic Apparatus | Narishige | 16030 | |
| SomnoSuite Low-Flow Anesthesia System | Kent Scientific Corporation | SS-01 | |
| Stimulation laser: Olympus-specific SPECTRA PHYSICS MAI TAI HP DEEP SEE-OL pulsed IR LASER, tunable from 690 nm to 1040 nm, 100 fs pulse width at specimen plane | Spectra Physics |
References
- Ulevitch, R. J., Tobias, P. S. Recognition of gram-negative bacteria and endotoxin by the innate immune system. Current Opinion in Immunology. 11 (1), 19-22 (1999).
- Poltorak, A., et al. Defective LPS signaling in C3H/HeJ and C57BL/10ScCr mice: mutations in Tlr4 gene. Science. 282 (5396), 2085-2088 (1998).
- Bhattacharyya, S., Midwood, K. S., Yin, H., Varga, J. Toll-Like Receptor-4 Signaling Drives Persistent Fibroblast Activation and Prevents Fibrosis Resolution in Scleroderma. Advances in Wound Care. 6 (10), 356-369 (2017).
- Wadachi, R., Hargreaves, K. M. Trigeminal nociceptors express TLR-4 and CD14: a mechanism for pain due to infection. Journal of Dental Research. 85 (1), 49-53 (2006).
- Janssens, S., Beyaert, R. Role of Toll-like receptors in pathogen recognition. Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 637-646 (2003).
- Barratt, D. T., Klepstad, P., Dale, O., Kaasa, S., Somogyi, A. A. Innate Immune Signalling Genetics of Pain, Cognitive Dysfunction and Sickness Symptoms in Cancer Pain Patients Treated with Transdermal Fentanyl. PLoS One. 10 (9), 0137179 (2015).
- Paish, H. L., et al. Fibroblasts Promote Inflammation and Pain via IL-1alpha Induction of the Monocyte Chemoattractant Chemokine (C-C Motif) Ligand 2. American Journal of Pathology. 188 (3), 696-714 (2018).
- Turner, C. A., Eren-Kocak, E., Inui, E. G., Watson, S. J., Akil, H. Dysregulated fibroblast growth factor (FGF) signaling in neurological and psychiatric disorders. Seminars in Cell and Developmental Biology. 53, 136-143 (2016).
- Rommens, J. M., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping. Science. 245 (4922), 1059-1065 (1989).
- Madiai, F., et al. Anti-fibroblast growth factor-2 antibodies attenuate mechanical allodynia in a rat model of neuropathic pain. Journal of Molecular Neuroscience. 27 (3), 315-324 (2005).
- Hoffman, G. E., Smith, M. S., Verbalis, J. G. c-Fos and related immediate early gene products as markers of activity in neuroendocrine systems. Frontiers in Neuroendocrinology. 14 (3), 173-213 (1993).
- Ieni, A., et al. Morphological and Cellular Features of Innate Immune Reaction in Helicobacter pylori Gastritis: A Brief Review. International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), (2016).
- Brennen, W. N., Isaacs, J. T., Denmeade, S. R. Rationale behind targeting fibroblast activation protein-expressing carcinoma-associated fibroblasts as a novel chemotherapeutic strategy. Molecular Cancer Therapeutics. 11 (2), 257-266 (2012).
- Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomark Insights. 5, 9-20 (2010).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medicine & Science. 4 (9), 429-434 (2012).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
- Jonkman, J., Brown, C. M. Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques. Journal of Biomolecular Techniques. 26 (2), 54-65 (2015).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. American Journal of Pathology. 161 (6), 1961-1971 (2002).
- Tsutsumi, R., et al. PGE2 signaling through the EP4 receptor on fibroblasts upregulates RANKL and stimulates osteolysis. Journal of Bone and Mineral Research. 24 (10), 1753-1762 (2009).
- Golzio, M., Rols, M. P., Gabriel, B., Teissie, J. Optical imaging of in vivo gene expression: a critical assessment of the methodology and associated technologies. Gene Therapy. 11, 85-91 (2004).
- Victora, G. D., et al. Germinal center dynamics revealed by multiphoton microscopy with a photoactivatable fluorescent reporter. Cell. 143 (4), 592-605 (2010).
- Duemani Reddy, G., Kelleher, K., Fink, R., Saggau, P. Three-dimensional random access multiphoton microscopy for functional imaging of neuronal activity. Nature Neuroscience. 11 (6), 713-720 (2008).
- Kolesnikov, M., Farache, J., Shakhar, G. Intravital two-photon imaging of the gastrointestinal tract. Journal of Immunological Methods. 421, 73-80 (2015).
- Ruthazer, E. S., Cline, H. T. Multiphoton imaging of neurons in living tissue: Acquisition and analysis of time-lapse morphological data. Real-Time Imaging. 8 (3), 175-188 (2002).
- Liu, K., et al. In vivo Analysis of Dendritic Cell Development and Homeostasis. Science. 324 (5925), 392-397 (2009).
- Barber, P. R., et al. Multiphoton time-domain fluorescence lifetime imaging microscopy: practical application to protein-protein interactions using global analysis. Journal of the Royal Society Interface. 6, 93-105 (2009).
- Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (4), 723-742 (2011).
- Gaigalas, A. K., et al. The Development of Fluorescence Intensity Standards. Journal of Research of the National Institute of Standards and Technology. 106 (2), 381-389 (2001).
- Tian, T., Wang, Y., Wang, H., Zhu, Z., Xiao, Z. Visualizing of the cellular uptake and intracellular trafficking of exosomes by live-cell microscopy. Journal of Cellular Biochemistry. 111 (2), 488-496 (2010).
- Buckers, J., Wildanger, D., Vicidomini, G., Kastrup, L., Hell, S. W. Simultaneous multi-lifetime multi-color STED imaging for colocalization analyses. Optics Express. 19 (4), 3130-3143 (2011).
- Zheng, J. H., Walters, E. T., Song, X. J. Dissociation of dorsal root ganglion neurons induces hyperexcitability that is maintained by increased responsiveness to cAMP and cGMP. Journal of Neurophysiology. 97 (1), 15-25 (2007).
- Ingaramo, M., York, A. G., Andrade, E. J., Rainey, K., Patterson, G. H. Two-photon-like microscopy with orders-of-magnitude lower illumination intensity via two-step fluorescence. Nature Communications. 6, 8184 (2015).
- Makale, M., et al. Extended-working-distance multiphoton micromanipulation microscope for deep-penetration imaging in live mice and tissue. Journal of Biomedical Optics. 14 (2), 024032 (2009).
