JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genetics

In vivo functionele studie van ziekten-geassocieerde zeldzame menselijke varianten met behulp van Drosophila

Published: August 20, 2019
doi:
10.3791/59658
, , , ,
1Department of Molecular and Human Genetics,Baylor College of Medicine, 2Program in Developmental Biology,Baylor College of Medicine, 3Department of Pediatrics, Section of Neurology and Developmental Neuroscience,Baylor College of Medicine, 4Jan and Dan Duncan Neurological Research Institute,Texas Children’s Hospital, 5Department of Neuroscience,Baylor College of Medicine

Summary

Het doel van dit protocol is om het ontwerp en de prestaties van in vivo experimenten in Drosophila melanogaster te schetsen om de functionele gevolgen van zeldzame genvarianten in verband met menselijke ziekten te beoordelen.

Abstract

De vooruitgang in de sequentie technologie heeft het hele genoom en het geheel-exome datasets toegankelijker gemaakt voor zowel klinische diagnose als het geavanceerde onderzoek naar menselijke genetica. Hoewel een aantal silico-algoritmen zijn ontwikkeld om de pathogeniteit van de in deze gegevenssets geïdentificeerde varianten te voorspellen, zijn functionele studies van cruciaal belang om te bepalen hoe specifieke genomische varianten de eiwit functie beïnvloeden, vooral voor missense Varianten. In het netwerk van niet-gediagnosticeerde ziekten (UDN) en andere onderzoeksconsortia met een zeldzame ziekte worden model organismen (MO), waaronder Drosophila, C. elegans, zebravis en muizen, actief gebruikt om de functie van vermoedelijke humane ziekteveroorzakende Varianten. Dit protocol beschrijft een methode voor de functionele beoordeling van zeldzame menselijke varianten die worden gebruikt in de model organismen screening centrum Drosophila kern van het UDN. De workflow begint met het verzamelen van menselijke en MO-informatie uit meerdere openbare databases, waarbij de WebResource MARRVEL wordt gebruikt om te beoordelen of de variant waarschijnlijk bijdraagt aan de toestand van een patiënt en effectieve experimenten ontwerpt op basis van beschikbare kennis en middelen. Vervolgens worden genetische hulpmiddelen (bijv. T2A-GAL4 en UAS-Human cDNA-lijnen) gegenereerd om de functies van de interesse varianten in Drosophilate beoordelen. Bij de ontwikkeling van deze reagentia kunnen twee-pronged Functionele assays op basis van reddings-en overexpressie-experimenten worden uitgevoerd om de variant functie te beoordelen. In de reddingstak worden de endogene vlieg genen “gehumaniseerd” door het orthologeuze Drosophila gen te vervangen door referentie-of variant menselijke transgenen. In de overexpressie tak, de referentie en variant menselijke eiwitten zijn exogenously gedreven in een verscheidenheid van weefsels. In beide gevallen kan elke scoor bare fenotype (bijvoorbeeld letaliteit, oogmorfologie, elektrofysiologie) als uitlezen worden gebruikt, ongeacht de ziekte van belang. Verschillen waargenomen tussen referentie en variant allelen suggereren een variant-specifiek effect, en dus waarschijnlijk pathogeniteit. Dit protocol maakt snelle, in vivo evaluaties mogelijk van putatieve humane ziekteveroorzakende varianten van genen met bekende en onbekende functies.

Introduction

Patiënten met zeldzame ziekten ondergaan vaak een moeizame reis die wordt aangeduid als de “diagnostische Odyssee” om een accurate diagnose1te verkrijgen. De meeste zeldzame ziekten worden verondersteld te hebben een sterke genetische oorsprong, het maken van genetische/genomic analyseert kritische elementen van de klinische werk. In aanvulling op de kandidaat-genpanel sequencing en de Copy Number variatie-analyse op basis van chromosomale micro arrays, zijn whole-exome (WES) en Whole-genoom sequencing (WGS)-technologieën steeds meer waardevolle hulpmiddelen geworden in de afgelopen tien jaar2, 3. Momenteel is de diagnostische snelheid voor het identificeren van een bekende pathogene variant in Wes en WGS ~ 25% (hoger in pediatrische gevallen)4,5. Voor de meeste gevallen die niet gediagnosticeerd blijven na klinische WES/WGS, is een veelvoorkomend probleem dat er veel kandidaatgenen en varianten zijn. Volgende-generatie sequencing identificeert vaak nieuwe of ultra-zeldzame varianten in veel genen, en het interpreteren of deze varianten bijdragen aan de ziekte fenotypes is uitdagend. Hoewel de meeste onzin-of frame Shift-mutaties in genen worden beschouwd als verlies van functie (LOF) allelen als gevolg van nonsens-gemedieerde verval van de gecodeerde transcriptie, kunnen afslankende mutaties die in de laatste exonen zijn gevonden, aan dit proces ontsnappen en functioneren als goedaardig of gain-of-function (GoF) allelen6.

Bovendien, het voorspellen van de effecten van een missense allel is een lastige taak, omdat het kan resulteren in een aantal verschillende genetische scenario’s zoals voor het eerst beschreven door Herman Muller in de jaren 1930 (dat wil zeggen, amorph, hypomorph, hypermorph, antimorph, Neomorph, of Isomorph)7 . Talrijke in silico-Programma’s en methodologieën zijn ontwikkeld om de pathogeniteit van missense-varianten te voorspellen op basis van evolutionaire instandhouding, type aminozuur verandering, positie binnen een functioneel domein, allel-frequentie in de algemene populatie, en andere parameters8. Deze Programma’s zijn echter geen allesomvattende oplossing voor het oplossen van het gecompliceerde probleem van de interpretatie van varianten. Interessant is dat een recente studie heeft aangetoond dat vijf algemeen gebruikte voorspellend voorspelling van varianten (Polyphen9, SIFT10, Cadd11, Provean12, mutatie taster) overeenkomen met pathogeniteit ~ 80% van de tijd8 . Met name, zelfs wanneer alle algoritmen het erover eens zijn, geven ze een onjuiste voorspelling van pathogeniteit tot 11% van de tijd. Dit leidt niet alleen tot gebrekkige klinische interpretatie, maar kan ook onderzoekers ontmoedigen om nieuwe varianten op te volgen door ze onterecht als goedaardig te vermelden. Een manier om de huidige beperking van in silico-modellering aan te vullen, is om experimentele gegevens te leveren die het effect van de variant functie in vitro, ex vivo (bijv. gekweekte cellen, organoïden) of in vivo aantonen.

In vivo functionele studies van zeldzame ziekten geassocieerde varianten in MO hebben unieke sterktes13 en zijn goedgekeurd door vele zeldzame ziekte onderzoek initiatieven over de hele wereld, met inbegrip van de niet-gediagnosticeerde ziekten netwerk (UDN) in de Verenigde Staten en zeldzame Ziekten modellen & mechanismen (RDMM) netwerken in Canada, Japan, Europa en Australië14. Naast deze gecoördineerde inspanningen om MO-onderzoekers te integreren in de workflow voor diagnose van zeldzame ziekten en mechanistische studies op nationale schaal, hebben een aantal individuele samenwerkings onderzoeken tussen klinische en MO-onderzoekers geleid tot de ontdekking en karakterisering van vele nieuwe genen en varianten van de menselijke ziekte,82,83,84.

In het UDN ontvangt een gecentraliseerd model organismen screening Center (MOSC) inzendingen van kandidaatgenen en varianten met een beschrijving van de toestand van de patiënt en beoordeelt zij of de variant waarschijnlijk pathogeen is met informatica-instrumenten en in vivo Experimenten. In fase I (2015-2018) van het UDN bestond de MOSC uit een Drosophila kern [Baylor College of Medicine (BCM)] en Zebrafish core (University of Oregon) die samen werkten om gevallen te beoordelen. Met behulp van informatica analyse en een aantal verschillende experimentele strategieën in Drosophila en zebravis heeft de MOSC tot nu toe bijgedragen aan de diagnose van 132 patiënten, identificatie van 31 nieuwe syndromen55, ontdekking van verschillende nieuwe menselijke ziekte genen (bijv. EBF315, ATP5F1D16, TBX217, IRF2BPL18, COG419, WDR3720) en fenotypische expansie van bekende ziekten genen (bijv. CACNA1A21, ACOX122).

Naast projecten binnen het UDN hebben de kern onderzoekers van MOSC Drosophila bijgedragen aan nieuwe ziekteverwekkende genen in samenwerking met de centra voor Mendelian Genomics en andere initiatieven (bijv. ANKLE223, TM2D3 24, NRD125, ogdhl25, ATAD3A26, ARIH127, MARK328, dnmbp29) met dezelfde verzameling van informatica en genetische strategieën ontwikkeld voor het UDN. Gezien het belang van MO-studies over de diagnose van zeldzame ziekten, werd de MOSC uitgebreid met een C. elegans core en Second Zebrafish core (beide aan de Washington University in St. Louis) voor fase II (2018-2022) van het UDN.

Dit manuscript beschrijft een in vivo functioneel studie protocol dat actief wordt gebruikt in de UDN MOSC Drosophila core om te bepalen of missense varianten functionele gevolgen hebben voor het proteïne van belang met behulp van transgene vliegen die menselijke Eiwitten. Het doel van dit protocol is om MO-onderzoekers te helpen samen te werken met klinische onderzoeksgroepen om experimenteel bewijs te leveren dat een kandidaatvariant in een gen van belang functionele gevolgen heeft, waardoor de klinische diagnose wordt vergemakkelijkt. Dit protocol is vooral nuttig in een scenario waarin een onderzoeker van Drosophila wordt benaderd door een klinisch onderzoeker die een patiënt met een zeldzame ziekte heeft met een specifieke kandidaatvariant in een gen van belang.

Dit protocol kan worden onderverdeeld in drie elementen: (1) het verzamelen van informatie om de waarschijnlijkheid te beoordelen van de variant van de rente die verantwoordelijk is voor het fenotype van de patiënt en de haalbaarheid van een functioneel onderzoek in Drosophila, (2) het verzamelen bestaande genetische hulpmiddelen en het oprichten van nieuwe, en (3) het uitvoeren van functionele studies in vivo. Het derde element kan verder worden onderverdeeld in twee sub-elementen, gebaseerd op hoe de functie van een variant van belang kan worden beoordeeld (reddingsexperiment of overexpressie gebaseerde strategieën). Het is belangrijk op te merken dat dit protocol kan worden aangepast en geoptimaliseerd voor vele scenario’s buiten zeldzame monogene ziekte onderzoek (bijvoorbeeld, gemeenschappelijke ziekten, gen-omgeving interacties, en farmacologische/genetische schermen om therapeutische doelen te identificeren). De mogelijkheid om de functionaliteit en pathogeniteit van varianten te bepalen zal niet alleen de patiënt van belang ten goede komen door een accurate moleculaire diagnose te geven, maar zal ook bredere effecten hebben op zowel translationeel als fundamenteel wetenschappelijk onderzoek.

Protocol

1. het verzamelen van menselijke en MO-informatie om te beoordelen: waarschijnlijkheid van een variant van belang die verantwoordelijk is voor de fenotypes van de ziekte en de haalbaarheid van functionele studies in Drosophila Voer uitgebreide database en literatuur zoekopdrachten uit om te bepalen of de specifieke genen en varianten van belang zijn goede kandidaten om uit te leggen van het fenotype van de patiënt van belang. Specifiek, verzamelen van de volgende informatie. <li…

Representative Results

Functionele studie van de Novo missense variant in EBF3 gekoppeld aan neurodevelopmental fenotypesIn een 7-jarige man met neurodevelopmental fenotypes met inbegrip van hypotonie, ataxie, wereldwijde ontwikkelingsachterstand, en expressieve spraakstoornis, artsen en menselijke genetici bij de National Institutes of Health Ungediagnosticeerde ziekten project (UDP) identificeerde een de Novo missense variant (p. R163Q) in EBF3 (Early b-Cell factor 3)15,…

Discussion

Experimentele studies met Drosophila melanogaster bieden een robuust assay-systeem om de gevolgen van met de ziekte geassocieerde menselijke varianten te beoordelen. Dit is te wijten aan de grote hoeveelheid kennis en diverse genetische hulpmiddelen die zijn gegenereerd door veel onderzoekers in het veld vliegen over de afgelopen eeuw89. Net als elk ander experimenteel systeem is het echter belangrijk om de voorbehoud en beperkingen te erkennen die bestaan.

<st…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We danken Jose Salazar, Julia Wang en Dr. Karen Schulze voor de kritische lezing van het manuscript. We erkennen drs. ning Liu en XI Luo voor de functionele karakterisering van de TBX2 varianten die hier worden besproken. Niet-gediagnosticeerde ziekten Network model organismen screening Center werd ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) Gemeenschappelijk Fonds (U54 NS093793). H. T. C. werd verder ondersteund door de NIH [CNCDP-K12 en NINDS (1K12 NS098482)], de American Academy of Neurology (neuro Science Research Grant), het Burroughs Wellcome Fund (loopbaan prijs voor medische wetenschappers), de Child neurologie Society en de Child neurologie Foundation ( (DP5 OD026426) en de eerste onafhankelijkheids prijs van NIH Director. M. F. W. werd verder ondersteund door Simons Foundation (SFARI Award: 368479). S. Y. werd verder ondersteund door de NIH (R01 DC014932), de Simons Foundation (SFARI Award: 368479), de Alzheimer’s Association (nieuwe onderzoeker Research Grant: 15-364099), naman familie fonds voor fundamenteel onderzoek, en Caroline Wiess Law Fonds voor onderzoek in Moleculaire geneeskunde. Confocale microscopie bij BCM wordt deels ondersteund door NIH Grant U54HD083092 aan de intellectuele en ontwikkelings handicap Research Center (IDDRC) neuro Visualization core.

Materials

Drosophila Stocks for UAS-human cDNA transgenesis
Injection strains for transgenesis (D. melanogaster) BDSC #24871 Specific Reagent: VK33 (3rd chromosome) Injection line
Injection strains for transgenesis (D. melanogaster) BDSC #24872 Specific Reagent: VK37 (2nd chromosome) Injection line
Plasmid DNA
Cloning vector Thermo Fisher #12536-017 Specific Reagent: pDONR221
Drosophila transgenesis vector Gift from Drs. Johannes Bischof and Konrad Basler (Bischof et al., 2013 PNAS) Specific Reagent: pGW-HA.attB
Molecular biology kits and reagents
Agarose Sigma-Aldrich #A2790 Specific Reagent: Agarose (molecular biology grade)
Chemically Competent Cells (E. coli) Thermo Fisher #18265017 Specific Reagent: DH5α
DNA Gel Extraction kit Thermo Fisher #K210012 Specific Reagent: PureLink Gel Extraction Kit
DNA Isolation and purification kit Qiagen #27104 Specific Reagent: QIAprep Spin Miniprep Kit
High Fidelity Polymerase NEB #M0491 Specific Reagent: Q5 Polymerase kit
Recombinase mediated cloning system Thermo Fisher #11789020 Specific Reagent: Gateway BP Clonase kit
Recombinase mediated cloning system Thermo Fisher #11791100 Specific Reagent: Gateway LR Clonase II Enzyme kit
Site Directed Mutagenesis kit Agilent #200523 Specific Reagent: Quick Change II Mutagenesis kit
Electroretinogram Rig related equipment
ERG Analysis Molecular Devices N/A Specific Reagent: Axon pCLAMP 10 Data Software Package
ERG Data Collection LabX #R150358 Specific Reagent: ISO-DAM Isolated Biologic Amplifier
ERG Stimulator Astro-Med #S48 Specific Reagent: Square Pulse Stimulator
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boycott, K. M., et al. International Cooperation to Enable the Diagnosis of All Rare Genetic Diseases. The American Journal of Human Genetics. 100 (5), 695-705 (2017).
  2. Lupski, J. R., et al. Whole-Genome Sequencing in a Patient with Charcot-Marie-Tooth Neuropathy. New England Journal of Medicine. 362 (13), 1181-1191 (2010).
  3. Boycott, K. M., Vanstone, M. R., Bulman, D. E., MacKenzie, A. E. Rare-disease genetics in the era of next-generation sequencing: discovery to translation. Nature Reviews Genetics. 14 (10), 681-691 (2013).
  4. Yang, Y., et al. Molecular Findings Among Patients Referred for Clinical Whole-Exome Sequencing. JAMA. 312 (18), 1870 (2014).
  5. Lee, H., et al. Clinical Exome Sequencing for Genetic Identification of Rare Mendelian Disorders. JAMA. 312 (18), 1880 (2014).
  6. Coban-Akdemir, Z., et al. Identifying Genes Whose Mutant Transcripts Cause Dominant Disease Traits by Potential Gain-of-Function Alleles. The American Journal of Human Genetics. 103 (2), 171-187 (2018).
  7. Muller, H. J. Further studies on the nature and causes of gene mutations. Proceedings of the Sixth International Congress of Genetics. , 213-255 (1932).
  8. Ghosh, R., Oak, N., Plon, S. E. Evaluation of in silico algorithms for use with ACMG/AMP clinical variant interpretation guidelines. Genome Biology. 18 (1), 225 (2017).
  9. Adzhubei, I. A., et al. A method and server for predicting damaging missense mutations. Nature Methods. 7 (4), 248-249 (2010).
  10. Vaser, R., Adusumalli, S., Leng, S. N., Sikic, M., Ng, P. C. SIFT missense predictions for genomes. Nature Protocols. 11 (1), 1-9 (2016).
  11. Rentzsch, P., Witten, D., Cooper, G. M., Shendure, J. l., Kircher, M. CADD: predicting the deleteriousness of variants throughout the human genome. Nucleic Acids Research. , (2018).
  12. Choi, Y., Sims, G. E., Murphy, S., Miller, J. R., Chan, A. P. Predicting the functional effect of amino acid substitutions and indels. PloS ONE. 7 (10), 46688 (2012).
  13. Wangler, M. F., et al. Model Organisms Facilitate Rare Disease Diagnosis and Therapeutic Research. Genetics. 207 (1), 9-27 (2017).
  14. Oriel, C., Lasko, P. Recent Developments in Using Drosophila as a Model for Human Genetic Disease. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 2041 (2018).
  15. Chao, H. T., et al. A Syndromic Neurodevelopmental Disorder Caused by De Novo Variants in EBF3. American Journal of Human Genetics. 100 (1), 128-137 (2017).
  16. Oláhová, M., et al. Biallelic Mutations in ATP5F1D, which Encodes a Subunit of ATP Synthase, Cause a Metabolic Disorder. American Journal of Human Genetics. 102 (3), 494-504 (2018).
  17. Liu, N., et al. Functional variants in TBX2 are associated with a syndromic cardiovascular and skeletal developmental disorder. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2454-2465 (2018).
  18. Marcogliese, P. C., et al. IRF2BPL Is Associated with Neurological Phenotypes. American Journal of Human Genetics. 103 (2), 245-260 (2018).
  19. Ferreira, C. R., et al. A Recurrent De Novo Heterozygous COG4 Substitution Leads to Saul-Wilson Syndrome, Disrupted Vesicular Trafficking, and Altered Proteoglycan Glycosylation. The American Journal of Human Genetics. 103 (4), 553-567 (2018).
  20. Kanca, O., et al. De novo variants in WDR37 are associated with epilepsy, colobomas and cerebellar hypoplasia. Americal Journal of Human Genetics. , (2019).
  21. Luo, X., et al. Clinically severe CACNA1A alleles affect synaptic function and neurodegeneration differentially. PLOS Genetics. 13 (7), 1006905 (2017).
  22. Chung, H., et al. ACOX1 induces autoimmunity whereas a de novo gain of function variant induces elevated ROS and glial loss in humans and flies. Cell Metabolism. , (2019).
  23. Yamamoto, S., et al. A Drosophila Genetic Resource of Mutants to Study Mechanisms Underlying Human Genetic Diseases. Cell. 159 (1), 200-214 (2014).
  24. Jakobsdottir, J., et al. Rare Functional Variant in TM2D3 is Associated with Late-Onset Alzheimer’s Disease. PLoS Genetics. 12 (10), 1006327 (2016).
  25. Yoon, W. H., et al. Loss of Nardilysin, a Mitochondrial Co-chaperone for α-Ketoglutarate Dehydrogenase, Promotes mTORC1 Activation and Neurodegeneration. Neuron. 93 (1), 115-131 (2017).
  26. Harel, T., et al. Recurrent De Novo and Biallelic Variation of ATAD3A, Encoding a Mitochondrial Membrane Protein, Results in Distinct Neurological Syndromes. American Journal of Human Genetics. 99 (4), 831-845 (2016).
  27. Tan, K. L., et al. Ari-1 Regulates Myonuclear Organization Together with Parkin and Is Associated with Aortic Aneurysms. Developmental Cell. 45 (2), 226-244 (2018).
  28. Ansar, M., et al. Visual impairment and progressive phthisis bulbi caused by recessive pathogenic variant in MARK3. Human Molecular Genetics. 27 (15), 2703-2711 (2018).
  29. Ansar, M., et al. Bi-allelic Loss-of-Function Variants in DNMBP Cause Infantile Cataracts. The American Journal of Human Genetics. 103 (4), 568-578 (2018).
  30. Wang, J., et al. MARRVEL: Integration of Human and Model Organism Genetic Resources to Facilitate Functional Annotation of the Human Genome. The American Journal of Human Genetics. 100 (6), 843-853 (2017).
  31. Wang, J., Liu, Z., Bellen, H., Yamamoto, S. MARRVEL, a web-based tool that integrates human and model organism genomics information. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
  32. Mungall, C. J., et al. The Monarch Initiative: an integrative data and analytic platform connecting phenotypes to genotypes across species. Nucleic Acids Research. 45, 712-722 (2017).
  33. Hu, Y., Comjean, A., Mohr, S. E., Perrimon, N., Perrimon, N. Gene2Function: An Integrated Online Resource for Gene Function Discovery. Genes|Genomes|Genetics. 7 (8), 2855-2858 (2017).
  34. Ioannidis, N. M., et al. An Ensemble Method for Predicting the Pathogenicity of Rare Missense Variants. The American Journal of Human Genetics. 99 (4), 877-885 (2016).
  35. Szklarczyk, D., et al. The STRING database in 2017: quality-controlled protein–protein association networks, made broadly accessible. Nucleic Acids Research. 45 (1), 362-368 (2017).
  36. Hu, Y., et al. Molecular Interaction Search Tool (MIST): an integrated resource for mining gene and protein interaction data. Nucleic Acids Research. 46 (1), 567-574 (2018).
  37. Lawson, C. L., et al. EMDataBank unified data resource for 3DEM. Nucleic Acids Research. 44 (1), 396-403 (2016).
  38. Bienert, S., et al. The SWISS-MODEL Repository-new features and functionality. Nucleic Acids Research. 45 (1), 313-319 (2017).
  39. Webb, B., Sali, A. Comparative Protein Structure Modeling Using MODELLER. Current Protocols in Bioinformatics. 54, 1-37 (2016).
  40. Kelley, L. A., Mezulis, S., Yates, C. M., Wass, M. N., Sternberg, M. J. E. The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis. Nature Protocols. 10 (6), 845-858 (2015).
  41. Bamshad, M. J., et al. The Centers for Mendelian Genomics: A new large-scale initiative to identify the genes underlying rare Mendelian conditions. American Journal of Medical Genetics Part A. 158 (7), 1523-1525 (2012).
  42. Sobreira, N. L. M., et al. Matchmaker Exchange. Current Protocols in Human Genetics. 95, 1-15 (2017).
  43. Temple, G., et al. The completion of the Mammalian Gene Collection (MGC). Genome Research. 19 (12), 2324-2333 (2009).
  44. Katzen, F. Gateway ®Recombinational cloning: a biological operating system. Expert Opinion on Drug Discovery. 2 (4), 571-589 (2007).
  45. Venken, K. J. T., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: A BAC Transgenic Platform for Targeted Insertion of Large DNA Fragments in D. melanogaster. Science. 314 (5806), 1747-1751 (2006).
  46. Bischof, J., et al. A versatile platform for creating a comprehensive UAS-ORFeome library in Drosophila. Development. 140 (11), 2434-2442 (2013).
  47. Bischof, J., Sheils, E. M., Björklund, M., Basler, K. Generation of a transgenic ORFeome library in Drosophila. Nature Protocols. 9 (7), 1607-1620 (2014).
  48. Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. Journal of Visualized Experiments. (27), e1135 (2009).
  49. Balana, B., Taylor, N., Slesinger, P. A. Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells. Journal of Visualized Experiments. (44), e2189 (2010).
  50. Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific C31 integrases. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (9), 3312-3317 (2007).
  51. Ringrose, L. Transgenesis in Drosophila melanogaster. Methods in Molecular Biology. 561, 3-19 (2009).
  52. Venken, K. J. T., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: A BAC Transgenic Platform for Targeted Insertion of Large DNA Fragments in D. melanogaster. Science. 314 (5806), 1747-1751 (2006).
  53. Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phiC31. Genetics. 166 (4), 1775-1782 (2004).
  54. Greenspan, R. . Fly Pushing: The Thory and Practice of Drosophila Genetics. , (2004).
  55. Ashburner, M., Golic, K., Hawley, R. S. . Drosophila: A Laboratory Handbook. , (2005).
  56. Diao, F., White, B. H. A Novel Approach for Directing Transgene Expression in Drosophila: T2A-Gal4 In-Frame Fusion. Genetics. 190 (3), 1139-1144 (2012).
  57. Diao, F., et al. Plug-and-Play Genetic Access to Drosophila Cell Types using Exchangeable Exon Cassettes. Cell Reports. 10 (8), 1410-1421 (2015).
  58. Bellen, H. J., et al. The Drosophila Gene Disruption Project: Progress Using Transposons With Distinctive Site Specificities. Genetics. 188 (3), 731-743 (2011).
  59. Lee, P. -. T., et al. A gene-specific T2A-GAL4 library for Drosophila. eLife. 7, (2018).
  60. Venken, K. J. T., et al. MiMIC: a highly versatile transposon insertion resource for engineering Drosophila melanogaster genes. Nature Methods. 8 (9), 737-743 (2011).
  61. Li-Kroeger, D., et al. An expanded toolkit for gene tagging based on MiMIC and scarless CRISPR tagging in Drosophila. eLife. 7, (2018).
  62. Salazar, J. L., Yamamoto, S. Integration of Drosophila and Human Genetics to Understand Notch Signaling Related Diseases. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1066, 141-185 (2018).
  63. Wangler, M. F., Yamamoto, S., Bellen, H. J. Fruit Flies in Biomedical Research. Genetics. 199 (3), 639-653 (2015).
  64. Duffy, J. B. GAL4 system indrosophila: A fly geneticist’s swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
  65. Nagarkar-Jaiswal, S., et al. A library of MiMICs allows tagging of genes and reversible, spatial and temporal knockdown of proteins in Drosophila. eLife. 4, (2015).
  66. Dolph, P., Nair, A., Raghu, P. . Electroretinogram Recordings of Drosophila. (1), (2011).
  67. Lauwers, E., Verstreken, P. Assaying Mutants of Clathrin-Mediated Endocytosis in the Fly Eye. Methods in Molecular Biology. 1847, 109-119 (2018).
  68. Rhodes-Mordov, E., Samra, H., Minke, B. Electroretinogram (ERG) Recordings from Drosophila. Bio-Protocol. 5 (21), (2015).
  69. Deal, S., Yamamoto, S. Unraveling novel mechanisms of neurodegeneration through a large-scale forward genetic screen in Drosophila. Frontiers in Genetics. , (2019).
  70. Chouhan, A. K., et al. Uncoupling neuronal death and dysfunction in Drosophila models of neurodegenerative disease. Acta Neuropathologica Communications. 4 (1), 62 (2016).
  71. Lek, M., et al. Analysis of protein-coding genetic variation in 60,706 humans. Nature. 536 (7616), 285-291 (2016).
  72. Liberg, D., Sigvardsson, M., Akerblad, P. The EBF/Olf/Collier family of transcription factors: regulators of differentiation in cells originating from all three embryonal germ layers. Molecular and Cellular Biology. 22 (24), 8389-8397 (2002).
  73. Prasad, B. C., et al. Unc-3, a gene required for axonal guidance in Caenorhabditis elegans, encodes a member of the O/E family of transcription factors. Development. 125 (8), 1561-1568 (1998).
  74. Jinushi-Nakao, S., et al. Knot/Collier and Cut Control Different Aspects of Dendrite Cytoskeleton and Synergize to Define Final Arbor Shape. Neuron. 56 (6), 963-978 (2007).
  75. Pozzoli, O., Bosetti, A., Croci, L., Consalez, G. G., Vetter, M. L. Xebf3 is a regulator of neuronal differentiation during primary neurogenesis in Xenopus. Developmental Biology. 233 (2), 495-512 (2001).
  76. Wang, S. S., Lewcock, J. W., Feinstein, P., Mombaerts, P., Reed, R. R. Genetic disruptions of O/E2 and O/E3 genes reveal involvement in olfactory receptor neuron projection. Development. 131 (6), 1377-1388 (2004).
  77. Fulp, C. T., et al. Identification of Arx transcriptional targets in the developing basal forebrain. Human Molecular Genetics. 17 (23), 3740-3760 (2008).
  78. Gécz, J., Cloosterman, D., Partington, M. ARX: a gene for all seasons. Current Opinion in Genetics & Development. 16 (3), 308-316 (2006).
  79. Dubois, L., Vincent, A. The COE–Collier/Olf1/EBF–transcription factors: structural conservation and diversity of developmental functions. Mechanisms of Development. 108 (1-2), 3-12 (2001).
  80. Cook, R. K., et al. The generation of chromosomal deletions to provide extensive coverage and subdivision of the Drosophila melanogaster genome. Genome Biology. 13 (3), 21 (2012).
  81. Chao, H. -. T., et al. A Syndromic Neurodevelopmental Disorder Caused by De Novo Variants in EBF3. The American Journal of Human Genetics. 100 (1), 128-137 (2017).
  82. Sleven, H., et al. De Novo Mutations in EBF3 Cause a Neurodevelopmental Syndrome. The American Journal of Human Genetics. 100 (1), 138-150 (2017).
  83. Harms, F. L., et al. Mutations in EBF3 Disturb Transcriptional Profiles and Cause Intellectual Disability, Ataxia, and Facial Dysmorphism. The American Journal of Human Genetics. 100 (1), 117-127 (2017).
  84. Tanaka, A. J., et al. De novo variants in EBF3 are associated with hypotonia, developmental delay, intellectual disability, and autism. Molecular Case Studies. 3 (6), 002097 (2017).
  85. Blackburn, P. R., et al. Novel de novo variant in EBF3 is likely to impact DNA binding in a patient with a neurodevelopmental disorder and expanded phenotypes: patient report, in silico functional assessment, and review of published cases. Molecular Case Studies. 3 (3), 001743 (2017).
  86. Lopes, F., Soares, G., Gonçalves-Rocha, M., Pinto-Basto, J., Maciel, P. Whole Gene Deletion of EBF3 Supporting Haploinsufficiency of This Gene as a Mechanism of Neurodevelopmental Disease. Frontiers in Genetics. 8, 143 (2017).
  87. Liu, N., et al. Functional variants in TBX2 are associated with a syndromic cardiovascular and skeletal developmental disorder. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2454-2465 (2018).
  88. Mesbah, K., et al. Identification of a Tbx1/Tbx2/Tbx3 genetic pathway governing pharyngeal and arterial pole morphogenesis. Human Molecular Genetics. 21 (6), 1217-1229 (2012).
  89. Bellen, H. J., Yamamoto, S. Morgan’s legacy: fruit flies and the functional annotation of conserved genes. Cell. 163 (1), 12-14 (2015).
  90. Richards, S., et al. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genetics in Medicine. 17 (5), 405-423 (2015).
  91. McGary, K. L., Park, T. J., Woods, J. O., Cha, H. J., Wallingford, J. B., Marcotte, E. M. Systematic discovery of nonobvious human disease models through orthologous phenotypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (14), 6544-6549 (2010).
  92. Yamamoto, S., et al. A Drosophila Genetic Resource of Mutants to Study Mechanisms Underlying Human Genetic Diseases. Cell. 159, 200-214 (2014).
  93. Ausubel, F. M. . Current Protocols in Molecular Biology. , (1989).
  94. Rubin, G., Spradling, A. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science. 218 (4570), 348-353 (1982).
  95. Sun, Y., Sriramajayam, K., Luo, D., Liao, D. J. A Quick, Cost-Free Method of Purification of DNA Fragments from Agarose Gel. Journal of Cancer. 3, 93-95 (2012).
  96. Ronaghi, M. DNA Sequencing :A Sequencing Method Based on Real-Time Pyrophosphate. Science. 281 (5375), 363-365 (1998).
  97. Ho, S. N., Hunt, H. D., Horton, R. M., Pullen, J. K., Pease, L. R. Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction. Gene. 77 (1), 51-59 (1989).

Tags

DrosophilaIn Vivo Functional StudyRare Human VariantsDisease-associated VariantsProtein FunctionRescue ExperimentsOverexpression StudiesGal4-UAS SystemVisual SystemPhotoreceptors

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Harnish, J. M., Deal, S. L., Chao, H., Wangler, M. F., Yamamoto, S. In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila. J. Vis. Exp. (150), e59658, doi:10.3791/59658 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image