JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genetics

Drosophila를 사용하여 질병 관련 희소한 인간 이체의 생체 내 기능적인 연구

Published: August 20, 2019
doi:
10.3791/59658
, , , ,
1Department of Molecular and Human Genetics,Baylor College of Medicine, 2Program in Developmental Biology,Baylor College of Medicine, 3Department of Pediatrics, Section of Neurology and Developmental Neuroscience,Baylor College of Medicine, 4Jan and Dan Duncan Neurological Research Institute,Texas Children’s Hospital, 5Department of Neuroscience,Baylor College of Medicine

Summary

이 프로토콜의 목표는 인간 질병과 관련된 희귀 유전자 변이체의 기능적 결과를 평가하기 위해 Drosophila melanogaster에서 생체 내 실험의 설계 및 성능을 설명하는 것입니다.

Abstract

시퀀싱 기술의 발전으로 전체 게놈 및 전체 엑솜 데이터 세트는 임상 진단 및 최첨단 인간 유전학 연구 모두에 더 쉽게 접근할 수 있게 되었습니다. 이러한 데이터 세트에서 확인된 변이체의 병원성을 예측하기 위해 여러 가지 실리코 알고리즘이 개발되었지만, 기능적 연구는 특정 게놈 변이체가 단백질 기능에 미치는 영향을 결정하는 데 매우 중요합니다. 변종. 진단되지 않은 질병 네트워크 (UDN) 및 기타 희귀 질환 연구 컨소시엄에서, Drosophila, C. elegans,제브라피시 및 마우스를 포함하는 모형 유기체 (MO)는 가치 인간 질병의 기능을 평가하기 위하여 적극적으로 이용됩니다 변종. 이 프로토콜은 UDN의 모델 유기체 스크리닝 센터 초파리 코어에 사용되는 희귀 인간 변이체의 기능적 평가를 위한 방법을 기술한다. 워크플로는 여러 공용 데이터베이스에서 인간 및 MO 정보를 수집하는 것으로 시작하여 MARRVEL 웹 리소스를 사용하여 변형이 환자의 상태에 기여할 가능성이 있는지 여부와 사용 가능한 실험을 기반으로 효과적인 실험을 설계하는 것으로 시작됩니다. 지식과 자원을 활용합니다. 다음으로, 유전 적 도구 (예를 들어, T2A-GAL4 및 UAS-인간 cDNA 라인)는 초파리에서관심있는 변이체의 기능을 평가하기 위해 생성됩니다. 이러한 시약의 개발시, 구조 및 과발현 실험에 기초한 두 갈래 의 기능성 실험이 변형 기능을 평가하기 위해 수행될 수 있다. 구조 분지에서, 내인성 비행 유전자는 참조 또는 변이체 인간 형질전환유전자로 정형고성 Drosophila 유전자를 대체해서 “인간화”됩니다. 과발현 분지에서, 참조 및 변이체 인간 단백질은 다양한 조직에서 외인성으로 구동된다. 두 경우 모두, 임의의 코랭킹 표현형(예를 들어, 치사성, 눈 형태학, 전기생리학)은 관심 있는 질병에 관계없이 판독값으로 사용될 수 있다. 기준과 변이체 둘레 사이에 관찰된 차이는 변이체 특이적 효과, 따라서 가능성이 있는 병원성을 시사한다. 이 프로토콜은 알려진 및 알려지지 않은 기능을 가진 유전자의 가증한 인간 질병 유발 변이체의 신속하고 생체 내 평가를 허용합니다.

Introduction

희귀 질환 환자는 종종 정확한 진단을 얻기 위해 “진단 오디세이”라고불리는 힘든 여행을 겪습니다 1. 대부분의 희귀 한 질병은 유전 / 게놈 분석 임상 작업의 중요한 요소를 만드는 강한 유전 적 기원을 가지고 생각된다. 염색체 마이크로어레이에 기초한 후보 유전자 패널 염기서열 분석 및 카피 수 변이 분석 이외에, 전체 엑소메(WES) 및 전체 게놈 염기서열 분석(WGS) 기술은 지난 10년 동안 점점 더 가치 있는 도구가 되고 있다2, 3. 현재 WES 및 WGS에서 알려진 병원성 변이체를 확인하기 위한 진단율은 ~25%(소아의 경우 더 높는)4,5. 임상 WES/WGS 후에 진단되지 않는 남아 있는 대부분의 케이스를 위해, 일반적인 문제는 많은 후보 유전자 및 이체가 있다는 것입니다. 차세대 염기서열 분석은 종종 많은 유전자에서 신규또는 매우 드문 변이체를 식별하고, 이러한 변이체가 질병 표현형에 기여하는지 여부를 해석하는 것은 도전적입니다. 예를 들면, 유전자에 있는 대부분의 말도 안되는 또는 프레임 시프트 돌연변이는 인코딩된 전사체의 말도 안되는 중재된 부패 때문에 기능 상실 (LOF) eeles로 생각되더라도, 마지막 exons에서 찾아낸 돌연변이를 잘린 이 프로세스를 탈출하고 같이 기능할 수 있습니다 양성 또는 기능 의 이득 (GOF) 알레일6.

또한, 1930 년대에 허먼 뮬러에 의해 처음 설명 된 바와 같이 다른 유전 시나리오의 숫자 (즉, 변형, 가형, 과모프, 안티 모프, 네오모프, 또는 이소모프) 7 을 초래할 수 있기 때문에, 잘못된 알탐지 알레일의 효과를 예측하는 것은 어려운 작업입니다7 . 수많은 실리코 프로그램 및 방법론은 진화적 보존, 아미노산 변화의 유형, 기능적 영역 내위치, 일반 인구의 대문자 빈도에 기초하여 잘못된 변이체의 병원성을 예측하기 위해 개발되었으며, 및 기타 매개 변수8. 그러나 이러한 프로그램은 변형 해석의 복잡한 문제를 해결하기위한 포괄적 인 솔루션이 아닙니다. 흥미롭게도, 최근 연구는 5 개의 광범위하게 사용되는 변이체 병원성 예측알고리즘 (폴리펜 9, SIFT10,CADD11,PROVEAN12,돌연변이 테이스터)이 병원성 ~80 %에 동의한다는 것을 보여주었습니다8 . 특히, 모든 알고리즘이 동의하더라도, 그들은 시간의 11 %까지 병원성의 잘못된 예측을 반환합니다. 이것은 뿐만 아니라 결함이 있는 임상 해석으로 이끌어 냅니다 그러나 또한 양성으로 그(것)들을 거짓으로 나열하여 새로운 변이체에 후속에서 연구원을 단념할 수 있습니다. 실리코 모델링에서 현재의 한계를 보완하는 한 가지 방법은 시험관 내, 생체 외(예를 들어, 배양된 세포, 오르가노이드) 또는 생체내 변이체 기능의 효과를 입증하는 실험 데이터를 제공하는 것이다.

MO에 있는 희소한 질병 관련이체의 생체 내 기능적인 연구 결과는 13의 유일한 강점이 있고 미국에 있는 진단되지 않은 질병 네트워크 (UDN) 및 희소한을 포함하여 세계에 있는 많은 희소한 질병 연구 이니셔티브에 의해 채택되었습니다 캐나다, 일본, 유럽 및 호주의 질병 모델 및 메커니즘 (RDMM) 네트워크14. MO 연구자를 희귀 질환 진단 및 기계론 적 연구의 워크플로우에 통합하기 위한 이러한 협력적 노력 외에도 임상 및 MO 연구자 간의 다수의 개별 공동 연구결과가 발견으로 이어졌습니다. 및 많은 새로운 인간 질병을 일으키는 유전자및 변이체82,83,84의특성화.

UDN에서, 중앙 집중식 모형 유기체 검열 센터 (MOSC)는 환자의 상태에 대한 설명과 함께 후보 유전자 및 변이체의 제출을 수신하고 이체가 정보학 도구 및 생체 내에서 병원성일 가능성이 있는지 여부를 평가합니다. 실험. UDN의 단계 I (2015-2018)에서, MOSC는 Drosophila 코어 [의학의 베일러 대학 (BCM)] 및 얼룩말 물고기 코어 (오리건 대학)로 구성 사례를 평가하기 위해 협력했다. 정보학 분석 및 Drosophila와 zebrafish에 있는 다른 실험 전략의 수를 사용하여, MOSC는 지금까지 132명의 환자의 진단, 31의 새로운 증후군55의확인, 몇몇 새로운 인간발견의 진단에 기여했습니다 질병 유전자 (예를 들어, EBF315, ATP5F1D16, TBX217, IRF2BPL18, COG419, WDR3720)및 알려진 질병의 현상치 확장 유전자 (예: CACNA1A21,ACOX122).

UDN 내의 프로젝트 이외에, MOSC Drosophila 코어 연구원은 Mendelian 유전체학 및 그밖 이니셔티브를 위한 센터와 협력하여 새로운 질병 유전자 발견에 기여했습니다 (예를 들면, ANKLE223, TM2D3 24, NRD125, OGDHL25, ATAD3A26, ARIH127, MARK328, DNMBP29)동일한 정보학 및 유전 적 세트를 사용 UDN을 위해 개발된 전략. 희귀 질환 진단에 대한 MO 연구의 중요성을 감안할 때, MOSC는 UDN의 단계 II (2018-2022)에 대한 C. 예쁜 꼬마 코어와 두 번째 얼룩말 코어 (세인트 루이스의 워싱턴 대학 모두)를 포함하도록 확장되었습니다.

이 원고는 UDN MOSC Drosophila Core에서 활발히 사용되는 생체 내 기능적 연구 프로토콜을 설명하여 잘못된 변형이 인간을 발현하는 형질전환 파리를 사용하여 관심 단백질에 기능적 영향을 미치는지 여부를 결정합니다. 단백질. 이 프로토콜의 목표는 MO 연구원이 임상 연구 그룹과 협력하여 관심 유전자의 후보 변형이 기능적 결과를 가지고 있다는 실험적 증거를 제공하도록 돕고 임상 진단을 용이하게하는 것입니다. 이 프로토콜은 Drosophila 연구원이 관심있는 유전자에 있는 특정 후보 이체를 가진 희소한 질병 환자가 있는 임상 조사체에 의해 접근하는 시나리오에서 가장 유용합니다.

이 프로토콜은 세 가지 요소로 나눌 수 있습니다: (1) 환자 표현형및 Drosophila에서기능적 연구의 타당성에 대한 책임이 있는 관심의 변이체의 가능성을 평가하기 위해 정보를 수집, (2) 수집 기존 유전 도구 및 새로운 도구를 확립하고, (3) 생체 내에서 기능 적 연구를 수행. 세 번째 요소는 관심 있는 변형의 기능을 평가하는 방법(구조 실험 또는 과발현 기반 전략)에 따라 두 개의 하위 요소로 더 세분화될 수 있습니다. 이 프로토콜은 희귀 한 단일 원성 질환 연구 (예 : 일반적인 질병, 유전자 환경 상호 작용 및 약리학 / 유전 스크린)를 제외한 많은 시나리오에 적응하고 최적화 할 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 변이체의 기능과 병원성을 결정하는 능력은 정확한 분자 진단을 제공함으로써 관심있는 환자에게 유익할뿐만 아니라 번역 및 기본 과학 연구 모두에 더 광범위한 영향을 미칠 것입니다.

Protocol

1. 인간과 MO 정보를 수집하여 평가: 관심의 변형이 질병 표현형 및 초파리 기능 연구의 타당성에 대한 책임이 있는 가능성 광범위한 데이터베이스 및 문헌 검색을 수행하여 관심 있는 환자의 표현형을 설명하기 에 적합한 후보인지 여부를 결정합니다. 구체적으로 다음 정보를 수집합니다. 관심 유전자가 이전에 다른 유전 질환 (알려진 질병 유전자의 phenotypic 확?…

Representative Results

신경 발달 표현형에 연결된 EBF3에 있는 de novo 오해의 소지가 있는 변이체의 기능적인 연구근력 저하, 운동 실조, 글로벌 발달 지연 및 표현 성 언어 장애를 포함한 신경 발달 표현형을 가진 7 세 남성에서, 의사와 건강 미진단 질병 프로젝트의 국립 연구소에서 의사와 인간 유전학자 (UDP) EBF3(초기 B-세포 인자3)에서 de novo missense 변이체(p.R163Q)를 확인하되, COE(콜리?…

Discussion

Drosophila melanogaster를 이용한 실험 적인 연구 결과는 질병 관련 인간 이체의 결과를 평가하기 위하여 강력한 분석 시스템을 제공합니다. 이것은 지난 세기89년 동안 비행 필드에 있는 많은 연구원에 의해 생성된 지식 그리고 다양한 유전 공구의 큰 바디 때문이. 그러나 다른 실험 시스템과 마찬가지로 존재하는 주의 사항과 한계를 인정하는 것이 중요합니다.

<p class="jove_co…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

호세 살라자르, 줄리아 왕, 카렌 슐제 박사에게 원고를 비판적으로 읽어주신 것에 감사드립니다. 우리는 여기에 논의 된 TBX2 변종의 기능적 특성에 대해 닝 리우 박사와 Xi Luo 박사를 인정합니다. 진단되지 않은 질병 네트워크 모형 유기체 검열 센터는 건강의 국가 학회 (NIH) 공동 기금 (U54 NS093793)를 통해 지원되었습니다. H. T. C. NIH [CNCDP-K12 및 NINDS (1K12 NS098482)], 미국 신경학 아카데미 (신경 과학 연구 보조금), 버로우스 웰컴 기금 (의료 과학자를위한 경력 상), 아동 신경학회 및 아동 신경학 재단 ( PERF 엘터만 교부금), NIH 이사 조기 독립상 (DP5 OD026426). M. F. W. 사이먼스 재단 (SFARI 상: 368479)에 의해 추가 지원되었다. S. Y.는 NIH (R01 DC014932), 사이먼스 재단 (SFARI 상 : 368479), 알츠하이머 협회 (새로운 조사자 연구 보조금 : 15-364099), 기초 연구를위한 나만 가족 기금 및 캐롤라인 비스 법률 기금에 의해 추가지원되었습니다. 분자 의학. BCM의 공초점 현미경 검사법은 NIH Grant U54HD083092에 의해 부분적으로 지적 발달 장애 연구 센터 (IDDRC) 신경 시각화 코어에 의해 지원됩니다.

Materials

Drosophila Stocks for UAS-human cDNA transgenesis
Injection strains for transgenesis (D. melanogaster) BDSC #24871 Specific Reagent: VK33 (3rd chromosome) Injection line
Injection strains for transgenesis (D. melanogaster) BDSC #24872 Specific Reagent: VK37 (2nd chromosome) Injection line
Plasmid DNA
Cloning vector Thermo Fisher #12536-017 Specific Reagent: pDONR221
Drosophila transgenesis vector Gift from Drs. Johannes Bischof and Konrad Basler (Bischof et al., 2013 PNAS) Specific Reagent: pGW-HA.attB
Molecular biology kits and reagents
Agarose Sigma-Aldrich #A2790 Specific Reagent: Agarose (molecular biology grade)
Chemically Competent Cells (E. coli) Thermo Fisher #18265017 Specific Reagent: DH5α
DNA Gel Extraction kit Thermo Fisher #K210012 Specific Reagent: PureLink Gel Extraction Kit
DNA Isolation and purification kit Qiagen #27104 Specific Reagent: QIAprep Spin Miniprep Kit
High Fidelity Polymerase NEB #M0491 Specific Reagent: Q5 Polymerase kit
Recombinase mediated cloning system Thermo Fisher #11789020 Specific Reagent: Gateway BP Clonase kit
Recombinase mediated cloning system Thermo Fisher #11791100 Specific Reagent: Gateway LR Clonase II Enzyme kit
Site Directed Mutagenesis kit Agilent #200523 Specific Reagent: Quick Change II Mutagenesis kit
Electroretinogram Rig related equipment
ERG Analysis Molecular Devices N/A Specific Reagent: Axon pCLAMP 10 Data Software Package
ERG Data Collection LabX #R150358 Specific Reagent: ISO-DAM Isolated Biologic Amplifier
ERG Stimulator Astro-Med #S48 Specific Reagent: Square Pulse Stimulator
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boycott, K. M., et al. International Cooperation to Enable the Diagnosis of All Rare Genetic Diseases. The American Journal of Human Genetics. 100 (5), 695-705 (2017).
  2. Lupski, J. R., et al. Whole-Genome Sequencing in a Patient with Charcot-Marie-Tooth Neuropathy. New England Journal of Medicine. 362 (13), 1181-1191 (2010).
  3. Boycott, K. M., Vanstone, M. R., Bulman, D. E., MacKenzie, A. E. Rare-disease genetics in the era of next-generation sequencing: discovery to translation. Nature Reviews Genetics. 14 (10), 681-691 (2013).
  4. Yang, Y., et al. Molecular Findings Among Patients Referred for Clinical Whole-Exome Sequencing. JAMA. 312 (18), 1870 (2014).
  5. Lee, H., et al. Clinical Exome Sequencing for Genetic Identification of Rare Mendelian Disorders. JAMA. 312 (18), 1880 (2014).
  6. Coban-Akdemir, Z., et al. Identifying Genes Whose Mutant Transcripts Cause Dominant Disease Traits by Potential Gain-of-Function Alleles. The American Journal of Human Genetics. 103 (2), 171-187 (2018).
  7. Muller, H. J. Further studies on the nature and causes of gene mutations. Proceedings of the Sixth International Congress of Genetics. , 213-255 (1932).
  8. Ghosh, R., Oak, N., Plon, S. E. Evaluation of in silico algorithms for use with ACMG/AMP clinical variant interpretation guidelines. Genome Biology. 18 (1), 225 (2017).
  9. Adzhubei, I. A., et al. A method and server for predicting damaging missense mutations. Nature Methods. 7 (4), 248-249 (2010).
  10. Vaser, R., Adusumalli, S., Leng, S. N., Sikic, M., Ng, P. C. SIFT missense predictions for genomes. Nature Protocols. 11 (1), 1-9 (2016).
  11. Rentzsch, P., Witten, D., Cooper, G. M., Shendure, J. l., Kircher, M. CADD: predicting the deleteriousness of variants throughout the human genome. Nucleic Acids Research. , (2018).
  12. Choi, Y., Sims, G. E., Murphy, S., Miller, J. R., Chan, A. P. Predicting the functional effect of amino acid substitutions and indels. PloS ONE. 7 (10), 46688 (2012).
  13. Wangler, M. F., et al. Model Organisms Facilitate Rare Disease Diagnosis and Therapeutic Research. Genetics. 207 (1), 9-27 (2017).
  14. Oriel, C., Lasko, P. Recent Developments in Using Drosophila as a Model for Human Genetic Disease. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 2041 (2018).
  15. Chao, H. T., et al. A Syndromic Neurodevelopmental Disorder Caused by De Novo Variants in EBF3. American Journal of Human Genetics. 100 (1), 128-137 (2017).
  16. Oláhová, M., et al. Biallelic Mutations in ATP5F1D, which Encodes a Subunit of ATP Synthase, Cause a Metabolic Disorder. American Journal of Human Genetics. 102 (3), 494-504 (2018).
  17. Liu, N., et al. Functional variants in TBX2 are associated with a syndromic cardiovascular and skeletal developmental disorder. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2454-2465 (2018).
  18. Marcogliese, P. C., et al. IRF2BPL Is Associated with Neurological Phenotypes. American Journal of Human Genetics. 103 (2), 245-260 (2018).
  19. Ferreira, C. R., et al. A Recurrent De Novo Heterozygous COG4 Substitution Leads to Saul-Wilson Syndrome, Disrupted Vesicular Trafficking, and Altered Proteoglycan Glycosylation. The American Journal of Human Genetics. 103 (4), 553-567 (2018).
  20. Kanca, O., et al. De novo variants in WDR37 are associated with epilepsy, colobomas and cerebellar hypoplasia. Americal Journal of Human Genetics. , (2019).
  21. Luo, X., et al. Clinically severe CACNA1A alleles affect synaptic function and neurodegeneration differentially. PLOS Genetics. 13 (7), 1006905 (2017).
  22. Chung, H., et al. ACOX1 induces autoimmunity whereas a de novo gain of function variant induces elevated ROS and glial loss in humans and flies. Cell Metabolism. , (2019).
  23. Yamamoto, S., et al. A Drosophila Genetic Resource of Mutants to Study Mechanisms Underlying Human Genetic Diseases. Cell. 159 (1), 200-214 (2014).
  24. Jakobsdottir, J., et al. Rare Functional Variant in TM2D3 is Associated with Late-Onset Alzheimer’s Disease. PLoS Genetics. 12 (10), 1006327 (2016).
  25. Yoon, W. H., et al. Loss of Nardilysin, a Mitochondrial Co-chaperone for α-Ketoglutarate Dehydrogenase, Promotes mTORC1 Activation and Neurodegeneration. Neuron. 93 (1), 115-131 (2017).
  26. Harel, T., et al. Recurrent De Novo and Biallelic Variation of ATAD3A, Encoding a Mitochondrial Membrane Protein, Results in Distinct Neurological Syndromes. American Journal of Human Genetics. 99 (4), 831-845 (2016).
  27. Tan, K. L., et al. Ari-1 Regulates Myonuclear Organization Together with Parkin and Is Associated with Aortic Aneurysms. Developmental Cell. 45 (2), 226-244 (2018).
  28. Ansar, M., et al. Visual impairment and progressive phthisis bulbi caused by recessive pathogenic variant in MARK3. Human Molecular Genetics. 27 (15), 2703-2711 (2018).
  29. Ansar, M., et al. Bi-allelic Loss-of-Function Variants in DNMBP Cause Infantile Cataracts. The American Journal of Human Genetics. 103 (4), 568-578 (2018).
  30. Wang, J., et al. MARRVEL: Integration of Human and Model Organism Genetic Resources to Facilitate Functional Annotation of the Human Genome. The American Journal of Human Genetics. 100 (6), 843-853 (2017).
  31. Wang, J., Liu, Z., Bellen, H., Yamamoto, S. MARRVEL, a web-based tool that integrates human and model organism genomics information. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
  32. Mungall, C. J., et al. The Monarch Initiative: an integrative data and analytic platform connecting phenotypes to genotypes across species. Nucleic Acids Research. 45, 712-722 (2017).
  33. Hu, Y., Comjean, A., Mohr, S. E., Perrimon, N., Perrimon, N. Gene2Function: An Integrated Online Resource for Gene Function Discovery. Genes|Genomes|Genetics. 7 (8), 2855-2858 (2017).
  34. Ioannidis, N. M., et al. An Ensemble Method for Predicting the Pathogenicity of Rare Missense Variants. The American Journal of Human Genetics. 99 (4), 877-885 (2016).
  35. Szklarczyk, D., et al. The STRING database in 2017: quality-controlled protein–protein association networks, made broadly accessible. Nucleic Acids Research. 45 (1), 362-368 (2017).
  36. Hu, Y., et al. Molecular Interaction Search Tool (MIST): an integrated resource for mining gene and protein interaction data. Nucleic Acids Research. 46 (1), 567-574 (2018).
  37. Lawson, C. L., et al. EMDataBank unified data resource for 3DEM. Nucleic Acids Research. 44 (1), 396-403 (2016).
  38. Bienert, S., et al. The SWISS-MODEL Repository-new features and functionality. Nucleic Acids Research. 45 (1), 313-319 (2017).
  39. Webb, B., Sali, A. Comparative Protein Structure Modeling Using MODELLER. Current Protocols in Bioinformatics. 54, 1-37 (2016).
  40. Kelley, L. A., Mezulis, S., Yates, C. M., Wass, M. N., Sternberg, M. J. E. The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis. Nature Protocols. 10 (6), 845-858 (2015).
  41. Bamshad, M. J., et al. The Centers for Mendelian Genomics: A new large-scale initiative to identify the genes underlying rare Mendelian conditions. American Journal of Medical Genetics Part A. 158 (7), 1523-1525 (2012).
  42. Sobreira, N. L. M., et al. Matchmaker Exchange. Current Protocols in Human Genetics. 95, 1-15 (2017).
  43. Temple, G., et al. The completion of the Mammalian Gene Collection (MGC). Genome Research. 19 (12), 2324-2333 (2009).
  44. Katzen, F. Gateway ®Recombinational cloning: a biological operating system. Expert Opinion on Drug Discovery. 2 (4), 571-589 (2007).
  45. Venken, K. J. T., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: A BAC Transgenic Platform for Targeted Insertion of Large DNA Fragments in D. melanogaster. Science. 314 (5806), 1747-1751 (2006).
  46. Bischof, J., et al. A versatile platform for creating a comprehensive UAS-ORFeome library in Drosophila. Development. 140 (11), 2434-2442 (2013).
  47. Bischof, J., Sheils, E. M., Björklund, M., Basler, K. Generation of a transgenic ORFeome library in Drosophila. Nature Protocols. 9 (7), 1607-1620 (2014).
  48. Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. Journal of Visualized Experiments. (27), e1135 (2009).
  49. Balana, B., Taylor, N., Slesinger, P. A. Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells. Journal of Visualized Experiments. (44), e2189 (2010).
  50. Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific C31 integrases. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (9), 3312-3317 (2007).
  51. Ringrose, L. Transgenesis in Drosophila melanogaster. Methods in Molecular Biology. 561, 3-19 (2009).
  52. Venken, K. J. T., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: A BAC Transgenic Platform for Targeted Insertion of Large DNA Fragments in D. melanogaster. Science. 314 (5806), 1747-1751 (2006).
  53. Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phiC31. Genetics. 166 (4), 1775-1782 (2004).
  54. Greenspan, R. . Fly Pushing: The Thory and Practice of Drosophila Genetics. , (2004).
  55. Ashburner, M., Golic, K., Hawley, R. S. . Drosophila: A Laboratory Handbook. , (2005).
  56. Diao, F., White, B. H. A Novel Approach for Directing Transgene Expression in Drosophila: T2A-Gal4 In-Frame Fusion. Genetics. 190 (3), 1139-1144 (2012).
  57. Diao, F., et al. Plug-and-Play Genetic Access to Drosophila Cell Types using Exchangeable Exon Cassettes. Cell Reports. 10 (8), 1410-1421 (2015).
  58. Bellen, H. J., et al. The Drosophila Gene Disruption Project: Progress Using Transposons With Distinctive Site Specificities. Genetics. 188 (3), 731-743 (2011).
  59. Lee, P. -. T., et al. A gene-specific T2A-GAL4 library for Drosophila. eLife. 7, (2018).
  60. Venken, K. J. T., et al. MiMIC: a highly versatile transposon insertion resource for engineering Drosophila melanogaster genes. Nature Methods. 8 (9), 737-743 (2011).
  61. Li-Kroeger, D., et al. An expanded toolkit for gene tagging based on MiMIC and scarless CRISPR tagging in Drosophila. eLife. 7, (2018).
  62. Salazar, J. L., Yamamoto, S. Integration of Drosophila and Human Genetics to Understand Notch Signaling Related Diseases. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1066, 141-185 (2018).
  63. Wangler, M. F., Yamamoto, S., Bellen, H. J. Fruit Flies in Biomedical Research. Genetics. 199 (3), 639-653 (2015).
  64. Duffy, J. B. GAL4 system indrosophila: A fly geneticist’s swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
  65. Nagarkar-Jaiswal, S., et al. A library of MiMICs allows tagging of genes and reversible, spatial and temporal knockdown of proteins in Drosophila. eLife. 4, (2015).
  66. Dolph, P., Nair, A., Raghu, P. . Electroretinogram Recordings of Drosophila. (1), (2011).
  67. Lauwers, E., Verstreken, P. Assaying Mutants of Clathrin-Mediated Endocytosis in the Fly Eye. Methods in Molecular Biology. 1847, 109-119 (2018).
  68. Rhodes-Mordov, E., Samra, H., Minke, B. Electroretinogram (ERG) Recordings from Drosophila. Bio-Protocol. 5 (21), (2015).
  69. Deal, S., Yamamoto, S. Unraveling novel mechanisms of neurodegeneration through a large-scale forward genetic screen in Drosophila. Frontiers in Genetics. , (2019).
  70. Chouhan, A. K., et al. Uncoupling neuronal death and dysfunction in Drosophila models of neurodegenerative disease. Acta Neuropathologica Communications. 4 (1), 62 (2016).
  71. Lek, M., et al. Analysis of protein-coding genetic variation in 60,706 humans. Nature. 536 (7616), 285-291 (2016).
  72. Liberg, D., Sigvardsson, M., Akerblad, P. The EBF/Olf/Collier family of transcription factors: regulators of differentiation in cells originating from all three embryonal germ layers. Molecular and Cellular Biology. 22 (24), 8389-8397 (2002).
  73. Prasad, B. C., et al. Unc-3, a gene required for axonal guidance in Caenorhabditis elegans, encodes a member of the O/E family of transcription factors. Development. 125 (8), 1561-1568 (1998).
  74. Jinushi-Nakao, S., et al. Knot/Collier and Cut Control Different Aspects of Dendrite Cytoskeleton and Synergize to Define Final Arbor Shape. Neuron. 56 (6), 963-978 (2007).
  75. Pozzoli, O., Bosetti, A., Croci, L., Consalez, G. G., Vetter, M. L. Xebf3 is a regulator of neuronal differentiation during primary neurogenesis in Xenopus. Developmental Biology. 233 (2), 495-512 (2001).
  76. Wang, S. S., Lewcock, J. W., Feinstein, P., Mombaerts, P., Reed, R. R. Genetic disruptions of O/E2 and O/E3 genes reveal involvement in olfactory receptor neuron projection. Development. 131 (6), 1377-1388 (2004).
  77. Fulp, C. T., et al. Identification of Arx transcriptional targets in the developing basal forebrain. Human Molecular Genetics. 17 (23), 3740-3760 (2008).
  78. Gécz, J., Cloosterman, D., Partington, M. ARX: a gene for all seasons. Current Opinion in Genetics & Development. 16 (3), 308-316 (2006).
  79. Dubois, L., Vincent, A. The COE–Collier/Olf1/EBF–transcription factors: structural conservation and diversity of developmental functions. Mechanisms of Development. 108 (1-2), 3-12 (2001).
  80. Cook, R. K., et al. The generation of chromosomal deletions to provide extensive coverage and subdivision of the Drosophila melanogaster genome. Genome Biology. 13 (3), 21 (2012).
  81. Chao, H. -. T., et al. A Syndromic Neurodevelopmental Disorder Caused by De Novo Variants in EBF3. The American Journal of Human Genetics. 100 (1), 128-137 (2017).
  82. Sleven, H., et al. De Novo Mutations in EBF3 Cause a Neurodevelopmental Syndrome. The American Journal of Human Genetics. 100 (1), 138-150 (2017).
  83. Harms, F. L., et al. Mutations in EBF3 Disturb Transcriptional Profiles and Cause Intellectual Disability, Ataxia, and Facial Dysmorphism. The American Journal of Human Genetics. 100 (1), 117-127 (2017).
  84. Tanaka, A. J., et al. De novo variants in EBF3 are associated with hypotonia, developmental delay, intellectual disability, and autism. Molecular Case Studies. 3 (6), 002097 (2017).
  85. Blackburn, P. R., et al. Novel de novo variant in EBF3 is likely to impact DNA binding in a patient with a neurodevelopmental disorder and expanded phenotypes: patient report, in silico functional assessment, and review of published cases. Molecular Case Studies. 3 (3), 001743 (2017).
  86. Lopes, F., Soares, G., Gonçalves-Rocha, M., Pinto-Basto, J., Maciel, P. Whole Gene Deletion of EBF3 Supporting Haploinsufficiency of This Gene as a Mechanism of Neurodevelopmental Disease. Frontiers in Genetics. 8, 143 (2017).
  87. Liu, N., et al. Functional variants in TBX2 are associated with a syndromic cardiovascular and skeletal developmental disorder. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2454-2465 (2018).
  88. Mesbah, K., et al. Identification of a Tbx1/Tbx2/Tbx3 genetic pathway governing pharyngeal and arterial pole morphogenesis. Human Molecular Genetics. 21 (6), 1217-1229 (2012).
  89. Bellen, H. J., Yamamoto, S. Morgan’s legacy: fruit flies and the functional annotation of conserved genes. Cell. 163 (1), 12-14 (2015).
  90. Richards, S., et al. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genetics in Medicine. 17 (5), 405-423 (2015).
  91. McGary, K. L., Park, T. J., Woods, J. O., Cha, H. J., Wallingford, J. B., Marcotte, E. M. Systematic discovery of nonobvious human disease models through orthologous phenotypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (14), 6544-6549 (2010).
  92. Yamamoto, S., et al. A Drosophila Genetic Resource of Mutants to Study Mechanisms Underlying Human Genetic Diseases. Cell. 159, 200-214 (2014).
  93. Ausubel, F. M. . Current Protocols in Molecular Biology. , (1989).
  94. Rubin, G., Spradling, A. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science. 218 (4570), 348-353 (1982).
  95. Sun, Y., Sriramajayam, K., Luo, D., Liao, D. J. A Quick, Cost-Free Method of Purification of DNA Fragments from Agarose Gel. Journal of Cancer. 3, 93-95 (2012).
  96. Ronaghi, M. DNA Sequencing :A Sequencing Method Based on Real-Time Pyrophosphate. Science. 281 (5375), 363-365 (1998).
  97. Ho, S. N., Hunt, H. D., Horton, R. M., Pullen, J. K., Pease, L. R. Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction. Gene. 77 (1), 51-59 (1989).

Tags

DrosophilaIn Vivo Functional StudyRare Human VariantsDisease-associated VariantsProtein FunctionRescue ExperimentsOverexpression StudiesGal4-UAS SystemVisual SystemPhotoreceptors
check_url/59658?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Harnish, J. M., Deal, S. L., Chao, H., Wangler, M. F., Yamamoto, S. In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila. J. Vis. Exp. (150), e59658, doi:10.3791/59658 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image