Photostimulation par Femtosecond Laser Actives Extracellular-signal-regulated Kinase (ERK) Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase (ERK) Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells Photo
Summary
Le laser femtoseconde étroitement focalisé peut fournir la stimulation précise aux cellules en étant couplé dans une microscopie confocale permettant l’observation et la photostimulation en temps réel. La photostimulation peut activer des événements moléculaires cellulaires, y compris la voie de signalisation ERK et les éclairs mitochondriaux des espèces réactives d’oxygène.
Abstract
Le contrôle direct des événements moléculaires définis cellulaires est important pour les sciences de la vie. Récemment, des études ont démontré que la stimulation laser femtoseconde peut simultanément activer plusieurs voies de signalisation moléculaire cellulaire. Dans ce protocole, nous montrons qu’en couplant le laser femtoseconde dans un microscope confocal, les cellules peuvent être stimulées précisément par le laser étroitement focalisé. Certains processus moléculaires qui peuvent être observés simultanément sont ensuite activés. Nous présentons des protocoles détaillés de la photostimulation pour activer la voie de signalisation de kinase réglée de signal extracellulaire (ERK) dans les cellules de Hela. Les éclairs mitochondriaux des espèces réactives d’oxygène (ROS) et d’autres événements mitochondriaux peuvent également être stimulés si la focalisation de l’impulsion laser de femtoseconde sur une certaine structure tubulaire mitochondriale. Ce protocole comprend le prétraitement des cellules avant la photostimulation, la livraison de la photostimulation par un flash laser femtoseconde sur la cible, et l’observation / l’identification des changements moléculaires par la suite. Ce protocole représente un outil tout optique pour les recherches biologiques connexes.
Introduction
La technologie de contrôle des molécules de signalisation cellulaire est une partie importante du développement des sciences de la vie. Traditionnellement, la méthode la plus couramment utilisée est le traitement biochimique par des médicaments ou des matériaux biologiques1,2,3. Au cours de la dernière décennie, l’invention de l’optogénétique ouvre une nouvelle ère pour la modulation des signaux moléculaires cellulaires. La transfection avec des protéines sensibles à la lumière par génie génétique fait de la lumière un outil puissant pour moduler diverses activités protéiques dans les cellules cibles. Cette technologie a fait des progrès encourageants tels que l’excitation et l’inhibition du signal neuronal, la promotion de l’expression des gènes, la manipulation des modèles de signal cellulaire, menant différents destins cellulaires et la recherche pathologique4,5 ,6,7,8,9. Cependant, la lumière ne peut fonctionner qu’en transfectant les cellules avec des protéines optogénétiques. Au stade actuel, il existe des méthodes rares qui permettent à la lumière de contrôler les molécules cellulaires directement en plus de l’optogénétique.
Le laser Femtosecond a fait progresser les recherches biologiques en fournissant une excitation multiphoton efficace tout en maintenant une bonne sécurité biologique. En déployant diverses stratégies de traitement photo, il a réalisé de nombreuses réalisations telles que la microscopie multiphoton, les microsurgeries et les applications optogénétiques multiphoton10,11,12,13 ,14,15,16. Des études récentes montrent que la stimulation laser femtoseconde a été démontrée comme une méthode optique très efficace pour induire directement des événements de signalisation moléculaire. Il a été constaté que l’irradiation laser femtoseconde étroitement focalisée sur le réticulum endoplasmique (ER) est capable d’épuiser le calcium dans les urgences et d’activer les canaux de calcium activé par le calcium (CRAC) pour former des signaux de calcium dans les cellules17. Ce signal de calcium photo-activé peut se propager entre plusieurs types de cellules18,19,20. En outre, il a également la capacité d’activer les voies de signalisation cellulaire telles que le facteur nucléaire des cellules T activées (NFAT) et la voie de signalisation ERK21,22. En ajustant l’intensité et la localisation de l’exposition au laser femtoseconde dans les cellules, par exemple, en concentrant le laser sur les mitochondries, il peut influencer la morphologie mitochondriale et les événements moléculaires23,24, 25. Plus précisément, les éclats de la génération mitochondriale de ROS peuvent être excités par la photostimulation, qui est marquée comme clignotements fluorescents dans les mitochondries (mitoflashes).
Par conséquent, la technologie de photostimulation est d’un bon potentiel pour être largement appliquée dans la recherche biologique connexe. C’est également une bonne chance d’étendre les applications laser femtoseconde dans le contrôle des molécules de signalisation cellulaire et des fonctions en plus de la microscopie. Ici, nous fournissons les détails techniques de la photostimulation. La photostimulation est réalisée en couplant un laser femtoseconde à un microscope confocal pour fournir une cellule cible unique avec une photostimulation flash courte. Il peut initier une activation ERK efficace et contrôlable dans la cellule. Si la photostimulation est située sur la structure tubulaire mitochondriale, le potentiel de membrane mitochondriale, la morphologie, le ROS, et les pores de transition de perméabilité, peuvent tous être commandés par la photostimulation. Basé sur ce schéma de photostimulation, nous fournissons une méthode détaillée d’activer la voie de signalisation ERK et d’influencer les événements mitochondriaux multiples dans les cellules Hela. Ce protocole élucide le processus de la prestation de la stimulation laser femtoseconde dans les cellules cibles.
Le système de photostimulation est établi sur un microscope confocal avec un électrocouple laser femtoseconde en elle pour la stimulation simultanée et la microscopie continue. Le laser femtoseconde (longueur d’onde : 1 040 nm, taux de répétition : 50 MHz, largeur d’impulsion : 120 fs, puissance moyenne de sortie maximale : 1 W) est divisé en deux faisceaux avant le couplage. L’un est guidé à travers un télescope relais composé d’une paire de lentilles. Il est ensuite directement reflété dans l’ouverture arrière d’un objectif (60x, N.A. 1.2, immersion dans l’eau) pour former un focus diffraction-limite (Stim-A). L’autre est reflétée dans la trajectoire optique de balayage du microscope confocal pour fonctionner comme un mode de balayage à deux photons (Stim-B). Stim-A présente un point de focalisation fixe au centre du champ de vision (FOV). Stim-B est une zone de balayage confocal partiel pré-conçue dans le FOV. Stim-A et Stim-B sont représentés à la figure 1A. Une caméra CCD sous le miroir dichroique (DM) fournit l’imagerie de champ lumineux pour surveiller le foyer du laser de femtoseconde.
Il y a quelques éléments essentiels cruciaux pour les expériences suivantes. Dans ce protocole, une source laser en fibre femtoseconde (1040 nm, 50 MHz, 120 fs) est utilisée comme exemple. Dans la pratique, la plupart des oscillateurs commerciaux femtoseconde peuvent être utilisés tant que la largeur de l’impulsion est plus courte que 200 fs et la densité de puissance maximale devrait être au-dessus du niveau de 1011 – 1012 W/cm2. Par exemple, un laser Ti: Sapphire habituellement utilisé pour la microscopie multiphoton est capable de remplacer le laser femtoseconde montré dans la figure 1B. La puissance du laser et d’autres paramètres de photostimulation doivent être réglés parce que les paramètres optiques (largeur d’impulsion, longueur d’onde et taux de répétition) varient beaucoup dans différents lasers femtosecondes qui induisent ainsi différentes excitations d’efficacité multiphoton.
En plus de la stimulation laser femtoseconde, la microscopie confocale fournit une imagerie cellulaire continue pour surveiller la dynamique moléculaire en temps réel dans les deux modes Stim-A et Stim-B. Les deux schémas de photostimulation (Stim-A et Stim-B) sont contrôlés par un obturateur mécanique à résolution milliseconde (figure 1).
En mode Stim-A, la position de mise au point laser est fixée au centre de FOV. Un télescope relais est utilisé pour assurer la mise au point du laser femtoseconde à être situé sur le plan d’imagerie confocale en admettant la distance entre deux lentilles dans la direction verticale (la direction de propagation laser, verticale au plan d’imagerie confocale, comme indiqué dans Figure 1). Grâce à l’imagerie sur le terrain lumineux de la caméra CCD, le diamètre de la mise au point laser peut être mesuré (2 m, figure 2B). Les durées de stimulation et les temps d’exposition sont contrôlés par un obturateur pendant le processus d’imagerie confocale.
En mode Stim-B, la zone de stimulation peut être pré-attribuée manuellement dans le logiciel de contrôle de l’imagerie confocale à n’importe quelle forme comme la ligne, le polygone ou le cercle. L’obturateur est synchronisé avec le processus de numérisation confocale. Il s’ouvre à l’heure pré-conçue qui est fixé par le logiciel de contrôle d’imagerie confocale. Ensuite, la zone de stimulation est numérisée par laser femtoseconde comme microscopie confocale. Ainsi, l’échantillon n’est stimulé par le laser femtoseconde que lorsque le processus de balayage confocal entre dans un cadre d’imagerie donné.
Le système de photostimulation peut être établi sur les microscopes métallurgiques inversés et droits selon les sujets de l’expérience. Les cellules in vitro cultivées dans les plats Petri sont préférables de travailler avec des microscopes inversés. Les animaux, en particulier les cerveaux des animaux vivants, sont plus appropriés avec des microscopes droits. Dans cette étude, nous prenons le microscope inversé comme exemple. Il convient de noter que la couverture du plat Petri n’est pas ouverte pendant l’ensemble des expériences.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous démontrons une stratégie de photostimulation en combinant un laser femtoseconde avec un système de microscope confocal de balayage laser. La photostimulation peut fonctionner directement comme une microscopie à deux photons en définissant Stim-B en conséquence. Nous fournissons un protocole détaillé pour l’utilisation d’un court flash de laser femtoseconde pour déclencher la signalisation ERK ou mitoflashes dans les cellules cibles. Les différents modes de stimulation peuvent être exécutés selon différ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les travaux ont été soutenus par la National Natural Science Foundation of China (81571719 et 81661168014, 81673014 et 81870055), le Shanghai Municipal Science and Technology Committee (18QA1402300 et 16XD1403100), et national Key R-D Plan (2017YFA0104000).
Materials
| inverted microscope | Olympus | ||
| femtosecond laser | Fianium | ||
| CO2 incubation system | Olympus | MIU-IBC | |
| petri dish | NEST | 801002 | |
| petri dish with imprinted grid | Ibidi | 81148 | |
| ERK-GFP | addgene | 37145 | A gift from Rony Seger's lab |
| mt-cpYFP | A gift from Heping Cheng's lab | ||
| mito-GFP | Invitrogen | C10508 | |
| Tetramethylrhodamine (TMRM) | Invitrogen | T668 | Dilute in DMSO |
| polyethylenimine (PEI) | Sigma-Aldrich | 9002-98-6 | Dilute in PBS |
| paraformaldehyde | Solarbio | P8430 | Dilute in PBS |
| Triton X-100 | Solarbio | T8200 | Dilute in PBS |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 | Dilute in PBS |
| Tween20 | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 | |
| anti-eIF4E antibody | abcam | ab76256 | |
| anti-Bax antibody | abcam | ab53154 | |
| anti-cytochrome C antibody | abcam | ab90529 | |
| secondary antibody (anti-Rabbit IgG H&L, Alexa Fluor 488) | abcam | ab150077 |
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