גירוי התמונה על ידי לייזר מפעיל בלייזר-האות-מוסדרים-קינאז (טיפשה) איתות או האירועים מיטוכונדריאלי בתאי היעד
Summary
לייזר ממוקד בצורה ממוקדת בשני התאים יכול לספק גירוי מדויק לתאי החיבור למיקרוסקופיה מרוכזת המאפשרת תצפית וגירוי בזמן אמת. הגירוי יכול להפעיל את האירועים המולקולריים תאים כולל מסלול מאותת והבזקים מיטוכונדריאלי של מינים חמצן תגובתי.
Abstract
בקרה ישירה של אירועים מולקולריים מוגדרים הסלולר חשוב למדעי החיים. לאחרונה, מחקרים הוכיחו כי גירוי לייזר של נשים במקביל יכול בו זמנית להפעיל מספר מסלולים מולקולריים סלולריים. בפרוטוקול זה, אנו מראים כי באמצעות צימוד לייזר מצמד לתוך מיקרוסקופ קונטואני, תאים יכולים להיות מגורה בדיוק על ידי הלייזר ממוקדת היטב. כמה תהליכים מולקולריים שניתן להבחין בו זמנית מופעלים לאחר מכן. אנחנו להציג פרוטוקולים מפורטים של הגירוי פוטותאי כדי להפעיל את האות מוסדר מוסדרים קינאז (טיפשה) מסלול איתות בתאי הלה. הבזקים מיטוכונדריאלי של מינים חמצן תגובתי (ROS) ואירועים מיטוכונדריאלי אחרים יכול להיות גם מגורה אם התמקדות הדופק לייזר של פטושני על מבנה מיטוכונדריאלי מסוים צינורי. פרוטוקול זה כולל התייחסות מראש לתאים לפני הפוטוסטימולציה, אספקת הפוטוסטימולציה על-ידי הבזק לייזר משני בלבד אל המטרה, והתבוננות/זיהוי של שינויים מולקולריים לאחר מכן. פרוטוקול זה מייצג כלי כולו אופטי עבור מחקרים ביולוגיים קשורים.
Introduction
הטכנולוגיה של שליטה מולקולות איתות הסלולר היא חלק חשוב של התפתחות מדעי החיים. באופן מסורתי, השיטה הנפוצה ביותר היא טיפול ביולוגי על ידי תרופות או חומרים ביולוגיים1,2,3. במהלך העשור האחרון, ההמצאה של אלקטרואופטיקה פותחת עידן חדש לאפנון תדר מולקולרי סלולרי. העברה עם חלבונים רגישים באור על ידי הנדסת גנים גורם לאור להפוך כלי רב עוצמה כדי לווסת את פעילות החלבונים השונים בתא היעד. טכנולוגיה זו הפכה עידוד מתקדם כגון עירור ועיכוב של אות עצבי, קידום ביטוי גנים, מניפולציה דפוסי האותות הסלולריים, מוביל גורלות תא שונים וחקירה פתולוגית4,5 ,6,7,8,9. עם זאת, אור יכול לעבוד רק על ידי הינע תאים עם חלבונים אלקטרואופטיקה. בשלב הנוכחי, קיימות שיטות נדירות המאפשרות אור לשלוט מולקולות הסלולר ישירות מלבד אלקטרואופטיקה.
לייזר פטושני יש מחקרים ביולוגיים מתקדמים על ידי מתן עירור רב-פוטון יעיל תוך שמירה על בטיחות ביולוגית טובה. על-ידי פריסת אסטרטגיות עיבוד מגוונות של תמונות, היא הבינה הישגים רבים כגון מיקרוסקופ רב-פוטון, מיקרוניתוחים ויישומים מרובי פוטון10,11,12,13 ,14,15,16. חקירות שנעשו לאחרונה מראים כי גירוי לייזר של הנשים השני הוכח כשיטה אופטית יעילה ביותר כדי לגרום ישירות לאירועים איתות מולקולרי. זה נמצא כי הקרנה הדוקה התמקדות בלייזר לייזר באופן הדוק על רשתית העין (ER) הוא מסוגל לרוקן את הסידן ב-ER ולהפעיל סידן המופעל לשחרר סידן (CRAC) ערוצים ליצור אותות סידן בתאים17. זה אות סידן המופעל באמצעות תמונה יכול להתפשט בין סוגים מרובים של תאים18,19,20. יתר על כן, יש לו גם את היכולת להפעיל משעולים תא איתות כגון גורם גרעיני של הפעלת תאים T (nfat) ו-איתות טיפשה מסלול21,22. על-ידי התאמת העוצמה והלוקליזציה של חשיפה לייזר של פטושניות בתאים, לדוגמה, התמקדות בלייזר על המיטו, היא יכולה להשפיע על מורפולוגיה מיטוכונדריאלי ואירועים מולקולריים23,24, 25. במיוחד, צרורות של הדור מיטוכונדריאלי יכול להיות נרגש על ידי פוטוגירוי, אשר העיר כמו הבזקי פלורסנט ב המיטוסיה (mitoflashes).
מכאן, הטכנולוגיה לגירוי התמונה הוא בעל פוטנציאל טוב להיות מיושם נרחב במחקר ביולוגי הקשורים. זוהי גם הזדמנות טובה להרחיב את היישומים לייזר של נשים בלייזר בשליטה של מולקולות איתות הסלולר פונקציות מלבד מיקרוסקופ. כאן, אנו מספקים את הפרטים הטכניים של הפוטוגריית. גירוי התמונה מושגת על ידי צימוד לייזר השני למיקרוסקופ מיקוד כדי לספק תא יעד יחיד עם פוטוגריית פלאש קצר. זה יכול ליזום הפעלה יעילה וניתנת לשליטה של הטיפשה בתא. אם הגירוי הוא ממוקם על מבנה הכרישים מיטוכונדריאלי, הפוטנציאל הממברנה מיטוכונדריאלי, מורפולוגיה, ROS, ו חדירות מעבר נקבוביות, כל יכול להיות נשלט על ידי פוטוגריית. בהתבסס על הערכה זו גירוי תמונה, אנו מספקים שיטה מפורטת של הפעלת מסלול איתות טיפשה והשפעה על אירועים מיטוכונדריאלי מרובים בתאי הלה. פרוטוקול זה מהבהיר את התהליך של העברת גירוי לייזר משני בלבד לתאי המטרה.
מערכת הפוטוסטימולציה מבוססת על מיקרוסקופ קונטואני עם צימוד לייזר משני, לגירוי סימולטני ומיקרוסקופ רציף. לייזר המגלגל השני (אורך הגל: 1,040 ננומטר, קצב חזרה: 50 MHz, רוחב הדופק: 120 fs, מקסימום פלט כוח ממוצע: 1 W) הוא מפוצל לשתי קורות לפני צימוד. אחד מודרך דרך טלסקופ ממסר המורכב מזוג עדשות. לאחר מכן הוא משתקף ישירות לתוך הפתח האחורי של מטרה (60x, N.A. = 1.2, טבילה במים) כדי ליצור מוקד עקיפה-הגבלת (בתוך). השני משתקף בדרך הסריקה האופטית של מיקרוסקופ קונפוקלית וקדי לעבוד כמצב הסריקה שני פוטון (“היכל-בי”). מציג נקודת מיקוד קבועה במרכז שדה הראייה (FOV). הוא אזור סריקת מוקד חלקי. מתוכנן מראש ב-FOV . מוצג באיור 1A מצלמת CCD תחת דיקרואיק mirror (DM) מספק הדמיה בשדה בהיר עבור ניטור המוקד של לייזר משני של הלייזר.
ישנם כמה יסודות חיוניים. לניסויים הבאים בפרוטוקול זה, מקור לייזר של סיבים משני השניים (1040 ננומטר, 50 MHz, 120 fs) משמש כדוגמה. בפועל, רוב המאיירים מסחרי המסחרי השני יכול לשמש כל עוד רוחב הדופק קצר יותר 200 fs ואת צפיפות הכוח שיא צריך להיות מעל רמה של 1011 ~ 10 ו/cm2. לדוגמה, Ti: לייזר ספיר משמש בדרך כלל עבור מיקרוסקופ מולטי פוטון מסוגל להחליף את הלייזר השני הראה באיור 1B. הכוח לייזר וכמה פרמטרים אחרים הגירוי צריך להיות מכוון מכיוון הפרמטרים האופטיים (רוחב הדופק, אורך הגל, ושיעור חזרה) לשנות הרבה לייזרים שונים לנשים שונות, כי ובכך לגרום שונה מרובת פוטון עירור יעילות.
יחד עם גירוי לייזר בשתי השניות, המיקרוסקופיה הקונפוקלית מספקת הדמיה תאית רציפה לניטור הדינמיקה המולקולרית בזמן אמת במצבי הפעולה של הקרן והקיטור. הן מערכות הפוטוסטימולציה (“היכל הקיטור” ו-“בלטה-B”) נשלטות על-ידי תריס מכני עם רזולוציה אלפית שניה (איור 1).
במצב של לייזר, מיקום מוקד הלייזר מתוקן במרכז FOV. הטלסקופ ממסר משמש כדי להבטיח את המיקוד של לייזר שנייה להיות ממוקם על מטוס הדמיה קונפוקלית ידי כוונון המרחק בין שתי עדשות בכיוון האנכי (הפצת לייזר כיוון, אנכית למישור הדמיה קונפוקלית, כפי שמוצג ב איור 1). על ידי הדמיה בשדה בהיר של מצלמת CCD, את קוטר המוקד לייזר ניתן למדוד (~ 2 μm, איור 2B). משכי הגירוי וזמני החשיפה נשלטים על ידי תריס במהלך תהליך הדימות הקונמוקד.
במצב-B, ניתן להקצות מראש את אזור הגירוי באופן ידני בתוכנת הבקרה הדמיה של ההדמיה לכל צורה כמו קו, מצולע או עיגול. התריס מסונכרן עם תהליך הסריקה הקונקלית. זה נפתח בזמן מעוצב מראש אשר מוגדר באמצעות הדמיה קונפוקלית וקד השליטה בתוכנה. לאחר מכן, אזור הגירוי נסרק על-ידי לייזר משני בתור מיקרוסקופ קונטואני. לפיכך, המדגם מגורה רק על ידי לייזר משני בלבד כאשר תהליך סריקה מיקוד נכנס מסגרת הדמיה נתונה.
ניתן להקים את מערכת הפוטוסטימולציה בעזרת מיקרוסקופ מתכות הפוך וזקוף בהתאם לנושאי הניסוי. בתאי מבחנה מתורבתים בצלחות פטרי עדיף לעבוד עם מיקרוסקופים הפוכה. בעלי חיים, בעיקר המוחות של חיות חיות, מתאימים יותר עם מיקרוסקופים זקוף. במחקר זה, אנו לוקחים את המיקרוסקופ הפוך כדוגמה. יצוין כי העטיפה של צלחת פטרי אינה נפתחת במהלך כל הניסויים.
Protocol
Representative Results
Discussion
אנו מדגימים אסטרטגיה פוטוסטימולציה על ידי שילוב לייזר משני השניים באמצעות סריקת לייזר ומערכת מיקרוסקופ קונטוטרציה. הגירוי יכול לעבוד ישירות כמיקרוסקופיה של שני הפוטונים על ידי הגדרת “היכל הקיטור” בהתאם. אנו מספקים פרוטוקול מפורט לניצול הבזק קצר של לייזר הפטושני להפעיל איתות של טיפשה או ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
העבודה נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (81571719 ו 81661168014, 81673014, ו 81870055), שנגחאי העיר המדע והטכנולוגיה הוועדה (18QA1402300 ו 16XD1403100), והמפתח הלאומי R & D תוכנית (2017YFA0104600).
Materials
| inverted microscope | Olympus | ||
| femtosecond laser | Fianium | ||
| CO2 incubation system | Olympus | MIU-IBC | |
| petri dish | NEST | 801002 | |
| petri dish with imprinted grid | Ibidi | 81148 | |
| ERK-GFP | addgene | 37145 | A gift from Rony Seger's lab |
| mt-cpYFP | A gift from Heping Cheng's lab | ||
| mito-GFP | Invitrogen | C10508 | |
| Tetramethylrhodamine (TMRM) | Invitrogen | T668 | Dilute in DMSO |
| polyethylenimine (PEI) | Sigma-Aldrich | 9002-98-6 | Dilute in PBS |
| paraformaldehyde | Solarbio | P8430 | Dilute in PBS |
| Triton X-100 | Solarbio | T8200 | Dilute in PBS |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 | Dilute in PBS |
| Tween20 | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 | |
| anti-eIF4E antibody | abcam | ab76256 | |
| anti-Bax antibody | abcam | ab53154 | |
| anti-cytochrome C antibody | abcam | ab90529 | |
| secondary antibody (anti-Rabbit IgG H&L, Alexa Fluor 488) | abcam | ab150077 |
References
- Papin, J. A., Hunter, T., Palsson, B. O., Subramaniam, S. Reconstruction of cellular signalling networks and analysis of their properties. Nature reviews Molecular cell biology. 6 (2), 99-111 (2005).
- Kholodenko, B. N. Cell-signalling dynamics in time and space. Nature reviews Molecular cell biology. 7 (3), 165-176 (2006).
- Scott, J. D., Pawson, T. Cell signaling in space and time: where proteins come together and when they’re apart. Science. 326 (5957), 1220-1224 (2009).
- Deisseroth, K. Optogenetics. Nature methods. 8 (1), 26-29 (2011).
- Deisseroth, K. Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nature neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).
- Konermann, S., et al. Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Nature. 500 (7463), 472-476 (2013).
- Toettcher, J. E., Weiner, O. D., Lim, W. A. Using optogenetics to interrogate the dynamic control of signal transmission by the Ras/Erk module. Cell. 155 (6), 1422-1434 (2013).
- Bugaj, L. J., et al. Cancer mutations and targeted drugs can disrupt dynamic signal encoding by the Ras-Erk pathway. Science. 361 (6405), eaao3048 (2018).
- Steinbeck, J. A., et al. Optogenetics enables functional analysis of human embryonic stem cell–derived grafts in a Parkinson’s disease model. Nature biotechnology. 33 (2), 204-209 (2015).
- Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
- Hoover, E. E., Squier, J. A. Advances in multiphoton microscopy technology. Nature photonics. 7 (2), 93-101 (2013).
- Yanik, M. F., et al. Neurosurgery: functional regeneration after laser axotomy. Nature. 432 (7019), 822 (2004).
- Tirlapur, U. K., König, K. Cell biology: targeted transfection by femtosecond laser. Nature. 418 (6895), 290-291 (2002).
- Shen, N., et al. Ablation of cytoskeletal filaments and mitochondria in live cells using a femtosecond laser nanoscissor. Mechanics & chemistry of Biosystems. 2 (1), 17-25 (2005).
- Packer, A. M., Russell, L. E., Dalgleish, H. W. P., Häusser, M. Simultaneous all-optical manipulation and recording of neural circuit activity with cellular resolution in vivo. Nature methods. 12 (2), 140-146 (2015).
- Rickgauer, J. P., Deisseroth, K., Tank, D. W. Simultaneous cellular-resolution optical perturbation and imaging of place cell firing fields. Nature neuroscience. 17 (12), 1816-1824 (2014).
- He, H., et al. Manipulation of cellular light from green fluorescent protein by a femtosecond laser. Nature Photonics. 6 (10), 651-656 (2012).
- Smith, N. I., et al. Photostimulation of two types of Ca2+ waves in rat pheochromocytoma PC12 cells by ultrashort pulsed near-infrared laser irradiation. Laser Physics Letters. 3 (3), 154-161 (2005).
- Zhao, Y., Liu, X., Zhou, W., Zeng, S. Astrocyte-to-neuron signaling in response to photostimulation with a femtosecond laser. Applied Physics Letters. 97 (6), 063703 (2010).
- He, H., et al. Ca2+ waves across gaps in non-excitable cells induced by femtosecond laser exposure. Applied Physics Letters. 100 (17), 173704 (2012).
- Wang, Y., et al. All-optical regulation of gene expression in targeted cells. Scientific reports. 4, 5346 (2014).
- Wang, S., et al. Photoactivation of Extracellular-Signal-Regulated Kinase Signaling in Target Cells by Femtosecond Laser. Laser & Photonics Reviews. 12 (7), 1700137 (2018).
- Yan, W., et al. Controllable generation of reactive oxygen species by femtosecond-laser irradiation. Applied Physics Letters. 104 (8), 083703 (2014).
- Wang, Y., et al. Photostimulation by femtosecond laser triggers restorable fragmentation in single mitochondrion. Journal of biophotonics. 10 (2), 286-293 (2017).
- Shi, F., et al. Mitochondrial swelling and restorable fragmentation stimulated by femtosecond laser. Biomedical optics express. 6 (11), 4539-4545 (2015).
- Scherer, W. F., Syverton, J. T., Gey, G. O. Studies on the propagation in vitro of poliomyelitis viruses. IV. Viral multiplication in a stable strain of human malignant epithelial cells (strain HeLa) derived from an epidermoid carcinoma of the cervix. Journal of Experimental Medicine. 97 (5), 695-710 (1953).
- Chang, L., Karin, M. Mammalian MAP kinase signalling cascades. Nature. 410 (6824), 37-40 (2001).
- Ebisuya, M., Kondoh, K., Nishida, E. The duration, magnitude and compartmentalization of ERK MAP kinase activity: mechanisms for providing signaling specificity. Journal of cell science. 118 (14), 2997-3002 (2005).
- Wang, W., et al. Superoxide flashes in single mitochondria. Cell. 134 (2), 279-290 (2008).
- Feng, G., Liu, B., Hou, T., Wang, X., Cheng, H. Mitochondrial Flashes: Elemental Signaling Events in Eukaryotic Cells. Pharmacology of Mitochondria. , 403-422 (2016).
- Hou, T., Wang, X., Ma, Q., Cheng, H. Mitochondrial flashes: new insights into mitochondrial ROS signalling and beyond. The Journal of physiology. 592 (17), 3703-3713 (2014).
- Wang, S., Hu, M., He, H. Quantitative analysis of mitoflash excited by femtosecond laser. Journal of biomedical optics. 23 (6), 065005 (2018).
