ביטוי מהיר ויעיל של חלבונים מרובים בעוברי העופות באמצעות mRNA אלקטרופורציה
Summary
אנו מדווחים על שליח RNA (mrna) אלקטרופורציה כשיטה המאפשרת ביטוי מהיר ויעיל של חלבונים מרובים במערכת דגם העובר שליו. שיטה זו ניתן להשתמש כדי לתייג תאים במהירות ולהקליט את התנועות שלהם vivo על ידי הזמן לשגות המיקרוסקופיה זמן קצר לאחר electroporation.
Abstract
אנו מדווחים כי mrna אלקטרופורציה מאפשר חלבונים פלורסנט כדי לתייג תאים בעוברי שליו חיים במהירות רבה יותר ובאופן נרחב יותר אלקטרופורציה DNA. היעילות הגבוהה ביותר מאפשרת לפחות 4 mRNAs ברורים להיות שיתוף מעבר עם ~ 87% יעילות. רוב מוצרי ה-mRNAs החשמליים מפוקעים במהלך 2 השעות הראשונות של הפוסט-אלקטרופורציה, ומאפשרות ניסויים תלויי זמן להתבצע בעובר המתפתח. בסופו של דבר, אנו מתארים כיצד התמונה באופן דינאמי בשידור חי העוברים עם mRNAs כי קידוד שונים ממוקד חלבונים פלורסנט ממוקדות.
Introduction
אלקטרופורציה היא שיטת העברה פיזית המשתמשת בפולס חשמלי כדי ליצור נקבוביות זמניות בקרום הפלזמה, המאפשר חומרים כמו חומצות גרעין או כימיקלים לעבור לתוך ציטוסול. אלקטרופורציה משמשת רבות כדי לספק דנ א לתוך חיידקים, שמרים, צמחים, ותאים מהיונקים1,2,3. הוא משמש באופן שגרתי כדי להחדיר מדים גנטיים לתוך תאים ורקמות היעד בתוך העובר העופות המתפתח ללמוד את השליטה הגנטית של פיתוח או תווית הגירה אוכלוסיות של תאים4,5,6, 7. לאחר מכן עם זאת, מספר מגבלות נסיוניות קיימות גם עם אלקטרופורציה DNA8. למשל, אלקטרופורציה DNA מציג לעתים קרובות מספר משתנה מאוד של וקטורים ביטויים לכל תא ולאחר מכן mRNAs וחלבונים הם לקודד. השונות הזאת עלולה להוביל לטרוגניות משמעותית בתאי התא, המסבך את ניתוח התמונה ואת פרשנות הנתונים9,10. בנוסף, חלבונים מ-DNA אלקטרופורציה רק מתחילים לבטא ~ 3 h פוסט אלקטרופורציה ולא להגיע ליעילות המקסימלית של מספר התא ואת עוצמת הקרינה עד 12 h, כנראה בשל הזמן הנדרש להעביר לתוך הגרעין ולהשלים תמלול ותרגום בvivo11.
לעומת זאת, השימוש ב-mrna משמש באופן יעיל במגוון מערכות מודל, כולל xenopus זריזה oocytes על ידי מיקרוהזרקה12,13, התכנות משנה את תאי הגזע האנושי על ידי mrna lipofectamine החצייה14 , ומרדנות בתאי גזע עצביים בעכברים למבוגרים15. בדקנו את היכולת של mrna אלקטרופורציה כדי לתייג ביעילות תאים במהלך פיתוח מוקדם העופות מתחלקים באמצעות מסונתז mrna באופן מתורבת לקודד חלבונים פלורסנט ברורים (FPs). ללימודים שלנו, השתמשנו pCS2 + וקטור, וקטור ביטוי רב-תכליתי המשמש בדרך כלל להבעת חלבונים ב xenopus ו-דג זברה עוברי. ה-RNA פולימו T7 מיזמים בpCS2 + היתר את הסינתזה של mRNA וחלבון מכל גן משוכפל כאשר משתמשים ב תמלול/מערכת תרגום של מבחנה.
כאן, אנו מדגימים כי mrna אלקטרופורציה מאפשר ביטוי מהיר ויעיל של חלבונים פלורסנט (FPs) בתוך העוברים שליו הגאוגעיים. עיצבנו ויצרנו רבים מוקטורי הביטוי בהם נעשה שימוש במחקרים אלה. לדוגמה, אנו שיכלנו משנה את הגן LifeAct-eGFP16 לתוך pCS2 + וקטור17 לבטא מן היזם CMV ו-SP6 מקדם. הגן המוסף נמצא במורד הזרם של מקדם SP6 ובמעלה הזרם של הזנב SV40 פולי (A)18. ב עוברים שיתוף electroporated עם mRNA ו-DNA, FPs מקודד מ-Mrna המועתק מחוץ לתחום שזוהו לראשונה בתוך 20 דקות של אלקטרופורציה, בעוד FPs של וקטורים ביטוי DNA אותרו רק לאחר 3 h. קידוד Mrna מרובים עבור גרעיני, Golgi, ו חלבונים קרום יכול להיות electroporated לתוך העובר בו זמנית, וכתוצאה מכך ביטוי מהיר ויעיל של חלבונים מרובים בתאים בודדים. בסופו של דבר, באמצעות התאוששות vivo פלואורסצנטית לאחר photobleaching לבנה (FRAP) שיטת, אנו מראים כי רוב הריקבון Mrporated הדעיכה בתוך 2 h. כך, ייצור חלבון ראשוני מהיר בשילוב עם תרגום חלבון חדש מוגבל הופך את mrna אלקטרופורציה טכניקה רבת ערך כאשר השליטה הטמפורלית של הביטוי הוא הכרחי.
Protocol
Representative Results
Discussion
בפרוטוקול זה, סיפקנו צעד אחר צעד הוראות על איך בדיוק מיקרו הזרקת ו אלקטרופורטה mRNA לתוך התאים של עוברי שליו הגאוגעיים. הדגמנו כי בתוך מתורבת מסונתז mrna אלקטרופורציה מאפשר ביטוי מהיר ויעיל של חלבונים פלורסנט (FPs) בתוך העוברים שליו הגאוגעיים (איור 2 ו -3). קרינה פלואורסצ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לדוד הוס על תובנות מועילות בעבודה זו. עבודה זו נתמכת בחלקו על ידי מלגת מחקר הקיץ של קרן רוז הילס (2016-2018) ומלגת מחקר של אוניברסיטת דרום קליפורניה ל-ת, מכון מחקר סבן במסגרת הכשרת טרום-דוקטורט לרפואה, ואוניברסיטת דרום קליפורניה מחקר הסמכה עמיתים התוכנית פרס ר
Materials
| BamHI-HF | New England Biolabs | R3136L | |
| BglII | New England Biolabs | R0144S | |
| BsrG1-HF | New England Biolabs | R3575S | |
| NotI-HF | New England Biolabs | R3189L | |
| SalI-HF | New England Biolabs | R3138L | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol | Thermo Fisher | 15593031 | |
| SP6 mMessage Machine in vitro transcription kit | Thermo Fisher | AM1340 | |
| Fast Green FCF | Sigma Aldrich | F7252 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 93443 | 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | 2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride, 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride, DAPI dihydrochloride |
| Whatman No.1 filter paper | Sigma Aldrich | WHA1001125 | |
| glycerol | Sigma Aldrich | G9012 | |
| Urea | Sigma Aldrich | 51457 | |
| pmTurquoise2-Golgi | Addgene | 36205 | pmTurquoise2-Golgi was a gift from Dorus Gadella (Addgene plasmid # 36205 ; http://n2t.net/addgene:36205 ; RRID:Addgene_36205) |
| pmEGFP-N1-LifeAct | Nat. Methods 2008;5:605-7. PubMed ID: 18536722 | ||
| pCS2.Lifeact-mGFP | Addgene | This paper | |
| pCS.H2B-citrine | Addgene | 53752 | pCS-H2B-citrine was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53752 ; http://n2t.net/addgene:53752 ; RRID:Addgene_53752) |
| pCS.memb-mCherry | Addgene | #53750 | pCS-memb-mCherry was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53750 ; http://n2t.net/addgene:53750 ; RRID:Addgene_53750) |
| Zeiss LSM-780 inverted microscope | Carl Zeiss Microscopy GmbH | The LSM-780 is a confocal and multi-photon microscope that offers the sensitivity required for vital imaging work. Equipped with a motorized stage, an autofocus device, and a full stage-top blackout incubator, the 780 is an excellent microscope for high-end live cell/embryo imaging. The high-sensitivity 32-channel Quasar detector allows for spectral imaging, linear unmixing, and high color count (>4) image acquisition. Excitation can be performed with 6 lines single photon lasers (405, 458, 488, 514, 564 and 633 nm), Chameleon (Coherent) 2-photon laser (range from 690nm to 1000nm), and run with ZEN 2011 SP7 (Black) system software. | |
| CUY-21 EDIT in vivo electroporator | Bex Co., Ltd. | ||
| Platinum flat square electrode, side length 5 mm | Bex Co., Ltd. | LF701P5E | |
| Olympus MVX10 FL Stereo Microscope | Olympus LifeScience | ||
| XM10 Monochrome camera | Olympus LifeScience | ||
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) for HCR (10×, pH 7.4) | To prepare 1 L of a 10× stock solution, combine 80 g of NaCl (Sigma-Aldrich S3014), 2 g of KCl (Sigma-Aldrich P9541), 11.4 g of Na2HPO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich S3264), and 2.7 g of KH2PO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich P9791). Adjust the pH to 7.4 with HCl, and bring the final volume to 1 L with ultrapure H2O. Avoid using CaCl2 and MgCl2 in PBS for HCR. It is important that the PBS for HCR is prepared as an RNase-free solution (e.g., via diethylpyrocarbonate [DEPC] treatment). | ||
| 1.37 M NaCl | |||
| 27 mM KCl | |||
| 80 mM Na2HPO4 20 mM KH2PO4 | |||
| PBS/Triton | Add 1 mL of Triton X-100 (Sigma Aldrich 93443) and 100 mL of 10× PBS to 890 mL of ultrapure distilled H2O. Filter the solution through a 0.2-μm filter and store it at 4 ̊C until use. | ||
| 1× phosphate-buffered saline (PBS) (DEPC-treated; pH 7.4) | |||
| 0.1% Triton X-100 |
References
- Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO Journal. 1 (7), 841-845 (1982).
- Potter, H. Electroporation in biology: methods, applications, and instrumentation. Analytical Biochemistry. 174 (2), 361-373 (1988).
- Shillito, R. D., Saul, M. W., Paszkowski, J., Muller, M., Potrykus, I. High-Efficiency Direct Gene-Transfer to Plants. Bio-Technology. 3 (12), 1099-1103 (1985).
- Cui, C., Rongish, B., Little, C., Lansford, R. Ex Ovo Electroporation of DNA Vectors into Pre-gastrulation Avian Embryos. CSH Protocol. 2007 (24), 4894 (2007).
- Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos. Nature Protocol. 3 (3), 419-426 (2008).
- Voiculescu, O., Stern, C. D. Manipulating Gene Expression in the Chick Embryo. Methods Molecular Biology. , 105-114 (2017).
- Chuai, M., et al. Cell movement during chick primitive streak formation. Developmental Bioliogy. 296 (1), 137-149 (2006).
- Krull, C. E. A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function. Developmental Dynamics. 229 (3), 433-439 (2004).
- Momose, T., et al. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Developmental, Growth and Differentiation. 41 (3), 335-344 (1999).
- Nakamura, H., Watanabe, Y., Funahashi, J. Misexpression of genes in brain vesicles by in ovo electroporation. Developmental, Growth and Differentiation. 42 (3), 199-201 (2000).
- Teddy, J. M., Lansford, R., Kulesa, P. M. Four-color, 4-D time-lapse confocal imaging of chick embryos. Biotechniques. 39 (5), 703-710 (2005).
- Green, M. R., Maniatis, T., Melton, D. A. Human beta-globin pre-mRNA synthesized in vitro is accurately spliced in Xenopus oocyte nuclei. Cell. 32 (3), 681-694 (1983).
- Mimoto, M. S., Christian, J. L. Manipulation of gene function in Xenopus laevis. Methods in Molecular Biology. 770, 55-75 (2011).
- Luni, C., et al. High-efficiency cellular reprogramming with microfluidics. Nature Methods. 13 (5), 446-452 (2016).
- Bugeon, S., et al. Direct and efficient transfection of mouse neural stem cells and mature neurons by in vivo mRNA electroporation. Development. 144 (21), 3968-3977 (2017).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
- Turner, D. L., Weintraub, H. Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate. Genes and Development. 8 (12), 1434-1447 (1994).
- Krieg, P. A., Melton, D. A. Functional messenger RNAs are produced by SP6 in vitro transcription of cloned cDNAs. Nucleic Acids Research. 12 (18), 7057-7070 (1984).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Eyal-Giladi, H., Kochav, S. From cleavage to primitive streak formation: a complementary normal table and a new look at the first stage of the development of the chick. I. General morphology. Developmental Biology. 49, 321-337 (1976).
- Ainsworth, S. J., Stanley, R. L., Evans, D. J. Developmental stages of the Japanese quail. Journal of Anatomy. 216 (1), 3-15 (2010).
- Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier. Developmental Dynamics. 220 (3), 284-289 (2001).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neurosciences. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- New, D. A new technique for the cultivation of the chick embryo in vitro. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 3, 320-331 (1955).
- Drake, C. J., Davis, L. A., Hungerford, J. E., Little, C. D. Perturbation of beta 1 integrin-mediated adhesions results in altered somite cell shape and behavior. Developmental Biology. 149 (2), 327-338 (1992).
- Sato, Y., et al. Dynamic analysis of vascular morphogenesis using transgenic quail embryos. PLoS ONE. 5 (9), e12674 (2010).
- Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Current Biology. 8 (7), 377-385 (1998).
- Uetrecht, A. C., Bear, J. E. Golgi polarity does not correlate with speed or persistence of freely migrating fibroblasts. European Journal of Cell Biology. 88 (12), 711-717 (2009).
- Alberts, B., et al. . Molecular Biology of the Cell. , (2007).
- Arndt-Jovin, D. J., Jovin, T. M. Fluorescence labeling and microscopy of DNA. Methods Cell Biol. 30, 417-448 (1989).
- Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. Luminescence digital imaging microscopy. Annu Rev Biophysics and Biophysical Chemistry. 18, 271-308 (1989).
- Heikal, A. A., Hess, S. T., Baird, G. S., Tsien, R. Y., Webb, W. W. Molecular spectroscopy and dynamics of intrinsically fluorescent proteins: coral red (dsRed) and yellow (Citrine). Proceedings of the National Academy of Science U S A. 97 (22), 11996-12001 (2000).
- Iizuka, R., Yamagishi-Shirasaki, M., Funatsu, T. Kinetic study of de novo chromophore maturation of fluorescent proteins. Analytical Biochemistry. 414 (2), 173-178 (2011).
- Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation. Mechanism of Development. 121 (9), 1137-1143 (2004).
- Swartz, M., Eberhart, J., Mastick, G. S., Krull, C. E. Sparking new frontiers: using in vivo electroporation for genetic manipulations. Developmental Biology. 233 (1), 13-21 (2001).
- Meyer, S., Temme, C., Wahle, E. Messenger RNA turnover in eukaryotes: pathways and enzymes. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 39 (4), 197-216 (2004).
- Bevilacqua, P. C., Ritchey, L. E., Su, Z., Assmann, S. M. Genome-Wide Analysis of RNA Secondary Structure. Annual Review in Genetics. 50, 235-266 (2016).
- Harland, R., Misher, L. Stability of RNA in developing Xenopus embryos and identification of a destabilizing sequence in TFIIIA messenger RNA. Development. 102 (4), 837-852 (1988).
- Lippincott-Schwartz, J. The long road: peering into live cells. Nature Cell Biology. 12 (10), 918 (2010).
- Sato, Y., Lansford, R. Transgenesis and imaging in birds, and available transgenic reporter lines. Development Growth & Differentiation. 55 (4), 406-421 (2013).
- Goldman, R. D., Spector, D. L. . Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. , (2005).
