Expresión rápida y eficiente de múltiples proteínas en embriones aviares utilizando la electroporación de ARNm
Summary
Reportamos la electroporación del ARN mensajero (ARNm) como un método que permite la expresión rápida y eficiente de múltiples proteínas en el sistema modelo de embriones de codorniz. Este método se puede utilizar para etiquetar fluorescentes las células y registrar sus movimientos in vivo mediante microscopía de lapso de tiempo poco después de la electroporación.
Abstract
Informamos que la electroporación de ARNm permite que las proteínas fluorescentes etiqueten las células en embriones de codorniz vivos de forma más rápida y amplia que la electroporación del ADN. La alta eficiencia de la transfección permite que al menos 4 ARNm distintos sean co-transfigurados con una eficiencia del 87 %. La mayoría de los ARNm electroportados se degradan durante las primeras 2 h después de la electroporación, lo que permite realizar experimentos sensibles al tiempo en el embrión en desarrollo. Por último, describimos cómo crear imágenes dinámicas de embriones vivos electroporados con ARNm que codifican varias proteínas fluorescentes subcelulares dirigidas.
Introduction
La electroporación es un método de transfección física que utiliza un pulso eléctrico para crear poros transitorios en la membrana plasmática, permitiendo que sustancias como ácidos nucleicos o productos químicos pasen al citosol. La electroporación se utiliza ampliamente para suministrar ADN en bacterias, levaduras, plantas y células de mamíferos1,2,3. Se utiliza rutinariamente para introducir cargas útiles genéticas en las células y tejidos diana dentro del embrión aviar en desarrollo para estudiar el control genético del desarrollo o etiquetar las poblaciones migratorias de células4,5,6, 7. Sin embargo, también existen varias limitaciones experimentales con la electroporación de ADN8. Por ejemplo, la electroporación de ADN a menudo introduce números muy variables de vectores de expresión por célula y posteriormente los ARNm y proteínas que codifican. Esta variabilidad puede dar lugar a una considerable heterogeneidad celular quecomplica tanto el análisis de imágenes como la interpretación de datos 9,10. Además, las proteínas de la electroporación del ADN sólo comienzan a expresar 3 h después de la electroporación y no alcanzan la máxima eficiencia en el número de células y la intensidad de la fluorescencia hasta las 12 h, probablemente debido al tiempo necesario para transferirse al núcleo y completar transcripción y traducción in vivo11.
Por el contrario, la transfección de ARNm se ha utilizado eficazmente en una variedad de sistemas de modelos, incluyendo ovocitos De Xenopus laevis por microinyección12,13, reprogramación de células madre humanas por transfección de lipofectamina mRNA14 , y electroporating de células madre neurales recalcitrantes en ratones adultos15. Probamos la capacidad de la electroporación de ARNm para etiquetar eficientemente las células durante el desarrollo embrionario aviar temprano utilizando ARNm sintetizados in vitro que codifican proteínas fluorescentes distintas (FPs). Para nuestros estudios, utilizamos el vector pCS2+, un vector de expresión multipropósito que se utiliza comúnmente para expresar proteínas en embriones de Xenopus y pez cebra. Los promotores de la polimerasa de ARN SP6 y T7 en el pCS2+ permiten la síntesis de ARNm y proteína de cualquier gen clonado cuando se utiliza en un sistema de transcripción/traducción in vitro.
Aquí, demostramos que la electroporación de ARNm permite la expresión rápida y eficiente de proteínas fluorescentes (FP) en embriones de codorniz gastrulantes. Diseñamos y generamos muchos de los vectores de expresión utilizados en estos estudios. Por ejemplo, subclonamos el gen LifeAct-eGFP16 en el vector pCS2+17 para expresarlo desde el promotor cmV y el promotor SP6. El gen insertado se encuentra aguas abajo del promotor SP6 y aguas arriba de la cola SV40 poli(A)18. En embriones coelectroportados con ARNm y ADN, los FP codificados a partir de ARNm transcritos in vitro se detectaron por primera vez en un plazo de 20 minutos de electroporación, mientras que los FP de vectores de expresión de ADN se detectaron sólo después de 3 h. Múltiples ARNm codificados para nuclear, Golgi y proteínas de membrana pueden electroporarse en un embrión simultáneamente, lo que resulta en la expresión rápida y eficiente de múltiples proteínas en células individuales. Finalmente, utilizando una recuperación de fluorescencia in vivo después del ensayo de fotoblanqueo (FRAP), mostramos que la mayoría de los ARNm electroportados se descomponen dentro de 2 h. Por lo tanto, la rápida producción inicial de proteínas combinada con una nueva traslación de proteínas limitada hace que la electroporación de ARNm sea una técnica valiosa cuando es necesario un control temporal de la expresión.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este protocolo, proporcionamos instrucciones paso a paso sobre cómo microinyectar y electroporar con precisión el ARNm en las células de los embriones de codorniz gastrulantes. Demostramos que la electroporación de ARNm sintetizada in vitro permite la expresión rápida y eficiente de proteínas fluorescentes (FP) en embriones de codorniz gastrulantes (Figura2 y 3). La fluorescencia de la proteína H2B-citrine traducida a partir de ARNm electroportados podría detecta…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a David Huss por sus útiles ideas sobre este trabajo. Este trabajo fue apoyado en parte por la Beca de Investigación de Verano de la Fundación Rose Hills (2016-2018) y la Beca de Investigación de Grado de USC Provost a M.T., el Saban Research Institute Intramural Training Pre-Doctoral Award to M.D., y la University of M.D., y la University of M.D., y la University of M.D., Premio al Programa de Asociados de Investigación de Grado del Sur de California a R.L.
Materials
| BamHI-HF | New England Biolabs | R3136L | |
| BglII | New England Biolabs | R0144S | |
| BsrG1-HF | New England Biolabs | R3575S | |
| NotI-HF | New England Biolabs | R3189L | |
| SalI-HF | New England Biolabs | R3138L | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol | Thermo Fisher | 15593031 | |
| SP6 mMessage Machine in vitro transcription kit | Thermo Fisher | AM1340 | |
| Fast Green FCF | Sigma Aldrich | F7252 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 93443 | 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | 2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride, 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride, DAPI dihydrochloride |
| Whatman No.1 filter paper | Sigma Aldrich | WHA1001125 | |
| glycerol | Sigma Aldrich | G9012 | |
| Urea | Sigma Aldrich | 51457 | |
| pmTurquoise2-Golgi | Addgene | 36205 | pmTurquoise2-Golgi was a gift from Dorus Gadella (Addgene plasmid # 36205 ; http://n2t.net/addgene:36205 ; RRID:Addgene_36205) |
| pmEGFP-N1-LifeAct | Nat. Methods 2008;5:605-7. PubMed ID: 18536722 | ||
| pCS2.Lifeact-mGFP | Addgene | This paper | |
| pCS.H2B-citrine | Addgene | 53752 | pCS-H2B-citrine was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53752 ; http://n2t.net/addgene:53752 ; RRID:Addgene_53752) |
| pCS.memb-mCherry | Addgene | #53750 | pCS-memb-mCherry was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53750 ; http://n2t.net/addgene:53750 ; RRID:Addgene_53750) |
| Zeiss LSM-780 inverted microscope | Carl Zeiss Microscopy GmbH | The LSM-780 is a confocal and multi-photon microscope that offers the sensitivity required for vital imaging work. Equipped with a motorized stage, an autofocus device, and a full stage-top blackout incubator, the 780 is an excellent microscope for high-end live cell/embryo imaging. The high-sensitivity 32-channel Quasar detector allows for spectral imaging, linear unmixing, and high color count (>4) image acquisition. Excitation can be performed with 6 lines single photon lasers (405, 458, 488, 514, 564 and 633 nm), Chameleon (Coherent) 2-photon laser (range from 690nm to 1000nm), and run with ZEN 2011 SP7 (Black) system software. | |
| CUY-21 EDIT in vivo electroporator | Bex Co., Ltd. | ||
| Platinum flat square electrode, side length 5 mm | Bex Co., Ltd. | LF701P5E | |
| Olympus MVX10 FL Stereo Microscope | Olympus LifeScience | ||
| XM10 Monochrome camera | Olympus LifeScience | ||
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) for HCR (10×, pH 7.4) | To prepare 1 L of a 10× stock solution, combine 80 g of NaCl (Sigma-Aldrich S3014), 2 g of KCl (Sigma-Aldrich P9541), 11.4 g of Na2HPO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich S3264), and 2.7 g of KH2PO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich P9791). Adjust the pH to 7.4 with HCl, and bring the final volume to 1 L with ultrapure H2O. Avoid using CaCl2 and MgCl2 in PBS for HCR. It is important that the PBS for HCR is prepared as an RNase-free solution (e.g., via diethylpyrocarbonate [DEPC] treatment). | ||
| 1.37 M NaCl | |||
| 27 mM KCl | |||
| 80 mM Na2HPO4 20 mM KH2PO4 | |||
| PBS/Triton | Add 1 mL of Triton X-100 (Sigma Aldrich 93443) and 100 mL of 10× PBS to 890 mL of ultrapure distilled H2O. Filter the solution through a 0.2-μm filter and store it at 4 ̊C until use. | ||
| 1× phosphate-buffered saline (PBS) (DEPC-treated; pH 7.4) | |||
| 0.1% Triton X-100 |
References
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