Rask og effektiv uttrykk for flere proteiner i avian embryo bruke mRNA electroporation

Summary

Vi rapporterer Messenger RNA (mRNA)-electroporation som en metode som tillater rask og effektiv uttrykk for flere proteiner i modell systemet vaktel embryo. Denne metoden kan brukes å fluorescensmerkete avmerke celler og fortegnelse deres inne vivo bevegelser av tid-lapse mikroskopi kort etter electroporation.

Abstract

Vi rapporterer at mRNA electroporation tillater fluorescerende proteiner å merke celler i levende vaktel embryo raskere og grovt enn DNA-electroporation. Den høye transfeksjoner effektivitet tillater minst 4 distinkte mRNAs å være co-transfekterte med ~ 87% effektivitet. De fleste av electroporated mRNAs er degradert i løpet av de første 2 h post-electroporation, tillater tidsfølsomme eksperimenter som skal utføres i utviklingsland embryo. Til slutt beskriver vi hvordan du dynamisk bilde Live embryo electroporated med mRNAs som koder ulike subcellulære målrettede fluorescerende proteiner.

Introduction

Electroporation er en fysisk transfeksjoner metode som bruker en elektrisk puls for å skape forbigående porer i plasma membranen, slik at stoffer som nukleinsyre syrer eller kjemikalier går over i stoffer. Electroporation er mye brukt til å levere DNA til bakterier, gjær, planter og pattedyrceller^1,2,3. Det er rutinemessig brukt til å innføre genetisk nyttelast i målceller og vev innenfor utviklingsland fugle embryo å studere genetisk kontroll av utvikling eller etikett migrere bestander av celler^{4,5,6, 7}i. Imidlertid finnes det også flere eksperimentelle begrensninger med DNA-electroporation⁸. For eksempel, DNA electroporation ofte introduserer svært variable antall uttrykk vektorer per celle og deretter mRNAs og proteiner de kodes. Denne variasjonen kan føre til betydelig celle celle heterogenitet som kompliserer både bildeanalyse og data tolkning^9,10. I tillegg proteiner fra DNA electroporation bare begynne å uttrykke ~ 3 h post-electroporation og ikke nå maksimal effektivitet i celle tall og fluorescens intensitet til 12 h, sannsynligvis på grunn av den tiden som kreves for å overføre til kjernen og fullføre både transkripsjon og oversettelse in vivo¹¹.

I kontrast har mRNA transfeksjoner blitt effektivt brukt i en rekke modellsystemer, inkludert Xenopus laevis oocytter av microinjection^12,13, omprogrammering humane stamceller ved mRNA lipofectamine transfeksjoner¹⁴ , og electroporating gjenstridige nevrale stamceller i voksne mus¹⁵. Vi testet evnen til mRNA electroporation å effektivt merke celler under tidlig avian embryoutvikling med in vitro syntetisert mRNAs som koder distinkte fluorescerende proteiner (FPs). For våre studier, vi brukte pCS2 + vektor, en Multipurpose uttrykk vektor som vanligvis brukes for å uttrykke proteiner i Xenopus og sebrafisk embryo. Den SP6 og T7 RNA polymerase arrangører i pCS2 + tillater syntese av mRNA og protein fra alle klonet genet når det brukes i en in vitro transkripsjon/Translation system.

Her viser vi at mRNA electroporation gir rask og effektiv uttrykk for fluorescerende proteiner (FPs) i gastrulating vaktel embryo. Vi har designet og generert mange av uttrykket vektorer som brukes i disse studiene. For eksempel subcloned vi LifeAct-eGFP genet¹⁶ i pCS2 + Vector¹⁷ å uttrykke fra CMV promoter og SP6 promoter. Den innsatte genet ligger nedstrøms av SP6 promoter og oppstrøms av SV40 Poly (A) hale¹⁸. I embryo co-electroporated med mRNA og DNA, ble FPs kodet fra in vitro kopieres mRNAs først oppdaget innen 20 min av electroporation, mens FPs fra DNA uttrykk vektorer ble oppdaget først etter 3 h. flere mRNAs-koding for kjernekraft, Golgi og membran proteiner kan electroporated inn i et embryo samtidig, noe som resulterer i rask og effektiv uttrykk for flere proteiner i individuelle celler. Til slutt, ved hjelp av en in vivo fluorescens Recovery etter photobleaching (FRAP) analysen, viser vi at et flertall av electroporated mRNAs forfall innen 2 t. Dermed vil den raske, første protein produksjonen kombinert med begrenset ny protein oversettelse gjøre mRNA electroporation til en verdifull teknikk når det er nødvendig med timelig kontroll av uttrykket.

Protocol

Alle dyr prosedyrer ble utført i samsvar med godkjente retningslinjer fra Children ‘ s Hospital Los Angeles og University of Southern California institusjonelle Animal Care og bruk komiteer. 1. generasjon pCS2-basert uttrykk vektorer Å klone pCS2. Lifeact-eGFP, forberede vektoren ryggraden ved å fordøye 2 μg av pCS2. CycB1-GFP (en konstruksjon som inneholder en annen innsats) med BamHI (10 U) og BsrGI (10 U) i riktig fordøyelsen buffer (se tabell over materialer) forty…

Representative Results

mRNA electroporation er mer effektiv enn DNA-electroporation Vi brukte pCS2 +. H2B-Citrin for å klargjøre in vitro mRNA. Siden DNA-electroporation vanligvis utføres ved 1-2 μg/μL, brukte vi en ekvimolare konsentrasjon av mRNA (beregnet til å være rundt 0,25-0,5 μg/μL for H2B-Citrin) for mRNA electroporation. Vi først testet electroporation effektiviteten av pCS2 +. H2B-Citrin DNA sammenlignet med H2B-C…

Discussion

I denne protokollen, ga vi steg for steg instruksjoner om hvordan du presist microinject og electroporate mRNA inn i cellene i gastrulating vaktel embryo. Vi viste at in vitro syntetisert mRNA electroporation gir rask og effektiv uttrykk for fluorescerende proteiner (FPs) i gastrulating vaktel embryo (figur 2 og 3). Fluorescens fra H2B-Citrin protein oversatt fra electroporated mRNAs kan oppdages av konfokalmikroskopi mikroskopi innen ~ 20 min og økt i FP-fluorescens i time…

Materials

BamHI-HF	New England Biolabs	R3136L
BglII	New England Biolabs	R0144S
BsrG1-HF	New England Biolabs	R3575S
NotI-HF	New England Biolabs	R3189L
SalI-HF	New England Biolabs	R3138L
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol	Thermo Fisher	15593031
SP6 mMessage Machine in vitro transcription kit	Thermo Fisher	AM1340
Fast Green FCF	Sigma Aldrich	F7252
Triton X-100	Sigma Aldrich	93443	4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether
DAPI	Sigma Aldrich	D9542	2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride, 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride, DAPI dihydrochloride
Whatman No.1 filter paper	Sigma Aldrich	WHA1001125
glycerol	Sigma Aldrich	G9012
Urea	Sigma Aldrich	51457
pmTurquoise2-Golgi	Addgene	36205	pmTurquoise2-Golgi was a gift from Dorus Gadella (Addgene plasmid # 36205 ; http://n2t.net/addgene:36205 ; RRID:Addgene_36205)
pmEGFP-N1-LifeAct			Nat. Methods 2008;5:605-7. PubMed ID: 18536722
pCS2.Lifeact-mGFP	Addgene		This paper
pCS.H2B-citrine	Addgene	53752	pCS-H2B-citrine was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53752 ; http://n2t.net/addgene:53752 ; RRID:Addgene_53752)
pCS.memb-mCherry	Addgene	#53750	pCS-memb-mCherry was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53750 ; http://n2t.net/addgene:53750 ; RRID:Addgene_53750)
Zeiss LSM-780 inverted microscope	Carl Zeiss Microscopy GmbH		The LSM-780 is a confocal and multi-photon microscope that offers the sensitivity required for vital imaging work. Equipped with a motorized stage, an autofocus device, and a full stage-top blackout incubator, the 780 is an excellent microscope for high-end live cell/embryo imaging. The high-sensitivity 32-channel Quasar detector allows for spectral imaging, linear unmixing, and high color count (>4) image acquisition. Excitation can be performed with 6 lines single photon lasers (405, 458, 488, 514, 564 and 633 nm), Chameleon (Coherent) 2-photon laser (range from 690nm to 1000nm), and run with ZEN 2011 SP7 (Black) system software.
CUY-21 EDIT in vivo electroporator	Bex Co., Ltd.
Platinum flat square electrode, side length 5 mm	Bex Co., Ltd.	LF701P5E
Olympus MVX10 FL Stereo Microscope	Olympus LifeScience
XM10 Monochrome camera	Olympus LifeScience
Phosphate-Buffered Saline (PBS) for HCR (10×, pH 7.4)			To prepare 1 L of a 10× stock solution, combine 80 g of NaCl (Sigma-Aldrich S3014), 2 g of KCl (Sigma-Aldrich P9541), 11.4 g of Na2HPO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich S3264), and 2.7 g of KH2PO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich P9791). Adjust the pH to 7.4 with HCl, and bring the final volume to 1 L with ultrapure H2O. Avoid using CaCl2 and MgCl2 in PBS for HCR. It is important that the PBS for HCR is prepared as an RNase-free solution (e.g., via diethylpyrocarbonate [DEPC] treatment).
1.37 M NaCl
27 mM KCl
80 mM Na2HPO4 20 mM KH2PO4
PBS/Triton			Add 1 mL of Triton X-100 (Sigma Aldrich 93443) and 100 mL of 10× PBS to 890 mL of ultrapure distilled H2O. Filter the solution through a 0.2-μm filter and store it at 4 ̊C until use.
1× phosphate-buffered saline (PBS) (DEPC-treated; pH 7.4)
0.1% Triton X-100