変異体メラノサイト幹細胞からのマウス黒色腫開始の空間的および時間的制御
Summary
以下の手順は、マウス背部皮膚における melanocytic 腫瘍開始の空間的および時間的な制御のための方法を説明する、遺伝子操作されたマウスモデルを使用する。このプロトコルは、肉眼的および微視的な皮膚黒色腫の開始を記載する。
Abstract
皮膚黒色腫は、最も攻撃的な皮膚癌としてよく知られている。リスク要因と主要な遺伝的変化は、増加する深さで文書化され続けているが、皮膚黒色腫の発生率は、近年の間に急速かつ連続的な増加を示している。効果的な予防方法を見つけるためには、皮膚における黒色腫開始の初期段階を理解することが重要です。以前のデータは、成体皮膚組織における濾胞性メラノサイト幹細胞 (MCSCs) が発癌突然変異および遺伝的改変を発現するときに起源のメラノーマ細胞として作用し得ることを実証した。黒色腫の発生しやすい MCSCs から生じる腫瘍形成は、静止状態から能動的に MCSCs 移行するときに誘発されます。黒色腫を起こしやすい MCSCs におけるこの移行は、毛包幹細胞の活性状態または紫外線 B (UV-B) のような外因性の環境因子の変調によって促進することができる。これらの因子は、実験室で化学脱毛によって人工的に操作することができ、毛包幹細胞および MCSCs を静止から活性状態に移行させ、卓上型光を用いて UV-B 曝露を引き起こす。これらの方法は、マウス背部皮膚における皮膚黒色腫開始の空間的および時間的な制御を成功させる。したがって、これらの in vivo モデルシステムは、皮膚黒色腫の開始の初期段階を定義するのに有益であり、腫瘍予防のための潜在的な方法を試験するために使用することができる。
Introduction
Melanocytic 腫瘍の悪性の形態である黒色腫は、皮膚悪性黒色腫を有する皮膚において最も攻撃的な癌であり、大部分の皮癌の死亡に関与している1.米国では、黒色腫は一般的に診断されます。20182の推定新癌症例の中でも 5番目から 6番目の最も一般的な癌型であると予測される。さらに、全体的な癌の発生率は、ここ数十年で徐々に減少している傾向を示しているが、過去数十年の間に皮膚黒色腫の発症速度は、両性2の連続的かつ急速に増加することを示している。
皮膚黒色腫に対してより効率的に対処するためには、臨床的に有効な予防的方法をよりよく特定するために、黒色腫の発生の初期の事象をその起源細胞から明確に理解することが重要である。成体幹細胞は、皮膚組織3、4、5を含む多くの異なる種類の器官において癌の細胞起源として腫瘍形成に有意に寄与し得ることが現在知られている。同様に、マウス背部皮膚における成人メラニン細胞幹細胞 (MCSCs) は、 Ras/RafおよびAkt経路6の異常な活性化の際に起源のメラノーマセルとして働くことができる。しかし、これらの発癌変異単独では、静止 MCSCs から腫瘍形成を効率的に誘導することはできない。 Melanocytic 腫瘍は、最終的に自然な髪のサイクリング中にアクティブになるときに発症します。しかし、このプロトコルでは、腫瘍を起こしやすい MCSCs の細胞活性化を人工的に誘発する方法を説明し、メラノーマの開始6,7の正確な制御を容易にします。
ここに記載された方法を通して、 Pten発現の損失と共に発癌BrafV600E を発現する腫瘍性 MCSCs からの皮膚黒色腫開始の空間的および時間的制御が首尾よく行われ、6を報告している。この方法は、脱毛を介して毛包幹細胞活性化を示し、UV B にマウスの皮膚の露出が毛包とこの細胞の転座に MCSCs の活性化を促進する方法を示す以前の所見を組み込んでいますinterfollicular 表皮6、8、9、10への亜集団。これらの in vivo モデルシステムは、生理的および環境的変化が黒色腫を起こしやすい MCSCs の細胞の状態をどのように変化させるかに関する貴重な情報を提供することができ、これは皮膚に黒色腫の著しい開始を誘発する可能性がある。
Protocol
Representative Results
Discussion
皮膚黒色腫腫瘍によく見られるホールマーク遺伝子改変がよく記載されている13.最も支配的なドライバ変異はBrafV600Eであり、 BrafV600E媒介性黒色腫の遺伝子組み換えマウスモデルはボーゼンベルクグループ14によって生成され、ジャクソン研究所に沈着した。このマウスモデルを用いて、我々の最近の研究は、背側皮膚<sup class="…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、ピアが受賞 W81XWH-16-1-0272 の下で癌研究プログラムを検討したことを通じて、保健省の補佐官の事務局長によって支持されました。意見、解釈、結論、および勧告は、著者のものであり、必ずしも国防総省によって承認されていません。この研究はまた、コーネル・ステム・セル・プログラムからのシード・グラントによっても支持されました。H. ムーンは、コーネル大学の脊椎動物ゲノム研究者プログラムによって支持されました。
Materials
| Tamoxifen | Sigma | T5648-1G | For systemic injection |
| Tamoxifen | Cayman Chemical | 13258 | For systemic injection |
| Corn oil | Sigma | 45-C8267-2.5L-EA | |
| 4OH-tamoxifen | Sigma | H7904-25MG | For topical treatment |
| 26g 1/2" needles | various | Veterinary grade | |
| 1 mL syringe | various | Veterinary grade | |
| Pet hair trimmer | Wahl | 09990-502 | |
| Hair removal cream | Nair | n/a | Available at most drug stores |
| Cotton swabs | various | ||
| Ultraviolet light bulb | UVP | 95-0042-08 | model XX-15M midrange UV lamp |
| 200 proof ethanol | various | pure ethanol | |
| Histoplast PE | Fisher Scientific | 22900700 | paraffin pellets |
| Neutral Buffered Formalin, 10% | Sigma | HT501128-4L | |
| Clear-Rite 3 | Thermo Scientific | 6901 | xylene substitute |
| O.C.T. Compound | Thermo | 23730571 | |
| Tissue Cassette | Sakura | 89199-430 | for FFPE processing |
| Cryomolds | Sakura | 4557 | 25 x 20 mm |
| FFPE metal mold | Leica | 3803082 | 24 x 24 mm |
| Isoflurane | various | Veterinary grade | |
| Anesthesia inhalation system | various | Veterinary grade | |
| Fine scissor | FST | 14085-09 | Straight, sharp/sharp |
| Fine scissor | FST | 14558-09 | Straight, sharp/sharp |
| Metzenbaum | FST | 14018-13 | Straight, blunt/blunt |
| Forcep | FST | 11252-00 | Dumont #5 |
| Forcep | FST | 11018-12 | Micro-Adson |
| Tyr-CreER; LSL-BrafV600E; Pten-f/f | Jackson Labs | 13590 | |
| LSL-tdTomato | Jackson Labs | 007914 | ai14 |
| Cre-1 | n/a | GCATTACCGGTCGATGCAACGAGTGATGAG | |
| Cre-2 | n/a | GAGTGAACGAACCTGGTCGAAATCAGTGCG | |
| Braf-V600E-1 | n/a | TGAGTATTTTTGTGGCAACTGC | |
| Braf-V600E-2 | n/a | CTCTGCTGGGAAAGCGGC | |
| Kras-G12D-1 | n/a | AGCTAGCCACCATGGCTTGAGTAAGTCTGCA | |
| Kras-G12D-2 | n/a | CCTTTACAAGCGCACGCAGACTGTAGA | |
| Pten-1 | n/a | ACTCAAGGCAGGGATGAGC | |
| Pten-2 | n/a | AATCTAGGGCCTCTTGTGCC | |
| Pten-3 | n/a | GCTTGATATCGAATTCCTGCAGC | |
| tdTomato-1 | n/a | AAGGGAGCTGCAGTGGAGTA | |
| tdTomato-2 | n/a | CCGAAAATCTGTGGGAAGTC | |
| tdTomato-3 | n/a | GGCATTAAAGCAGCGTATCC | |
| tdTomato-4 | n/a | CTGTTCCTGTACGGCATGG |
References
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