Изоляция и культура первичных аортальных эндотелиальных клеток от миниатюрных свиней
Summary
Описан эффективный ферментативный метод изоляции первичных свиных аортальных эндотелиальных клеток (ПАЭК) от миниатюрных свиней. Изолированные первичные PAECs могут быть использованы для исследования иммунной и свертывания ответ в ксенотрансплантации.
Abstract
Ксенотрансплантация является перспективным способом решения проблемы нехватки органов человека для пациентов с отказом органов на конечной стадии, и свинья считается подходящим источником органов. Иммунный отторжение и коагуляция являются двумя основными препятствиями для успеха ксенотрансплантации. Сосудистые эндотелиальные клетки (EC) травмы и дисфункции имеют важное значение для развития воспаления и коагуляции реакции при ксенотрансплантации. Таким образом, изоляция свиных аортальных эндотелиальных клеток (ПАЭК) необходима для исследования иммунного отторжения и реакции свертывания. Здесь мы разработали простой ферментативный подход к изоляции, характеристике и расширению высокоочищенных ПАЭК от миниатюрных свиней. Сначала миниатюрную свинью обезглавили кетамин, и была вырезана длина аорты. Во-вторых, эндотелиальная поверхность аорты подвергалась воздействию 0,005% коллагеназы IV пищеварительного раствора в течение 15 мин. В-третьих, эндотелиальная поверхность аорты была выцарапана только в одном направлении с помощью клеточного скребока (lt;10 раз), и не была сжата в процессе процесса Соскабливания. Наконец, изолированные PAECs Дня 3, и после прохождения 1 и прохода 2, были определены поток цитометрии с анти-CD31 антитела. Проценты CD31-положительных клеток составили 97,4% и 1,2%, 94,4% и 1,1% и 92,4% и 1,7% (средний SD), соответственно. Концентрация коллагеназа IV, пищеварительное время, направление, частота и интенсивность соскабливания имеют решающее значение для уменьшения загрязнения фибробластов и получения высокой чистоты и большого количества ОР. В заключение, наш ферментативный метод является высоко-эффктивный метод для изоляции ЭК от миниатюрной аорты свиньи, и клетки могут быть расширены в пробирке для исследования иммунной и коагуляционной реакции в ксенотрансплантации.
Introduction
Нехватка доступных органов для трансплантации является нерешенной проблемой во всем мире1. По данным Общества Красного Креста Китая, в 2018 году лишь небольшое число пациентов с органной недостаточностью конечной стадии получили подходящий орган в Китае.
Ксенотрансплантация является многообещающим способом решения проблемы нехватки органов. Свиньи органы считаются наиболее подходящими органами для человека из-за анатомических и физиологических сходств2,3. Отказ свиньи ксенотрансплантат в значительной степени связано с приматов иммунного отторжения и свертывания ответов. Свиные эндотелиальные клетки (ECs) имеют решающее значение, поскольку эти клетки являются первыми, чтобы взаимодействовать с иммунной системой приматов, которая включает в себя антитела, дополнение, цитокины, и иммунные клетки (например, Т-клетки, В-клетки, и макрофаги)4,5. Сочные eCs играют жизненно важную роль в орган евеноии и ксенотрансплантации газотечного6,7. Таким образом, ECs являются важными клетками для исследования отторжения и свертывания ответов на свиней трансплантата. Для исследования ксенотрансплантации требуется изоляция высококачественных свиных ЭК.
В попытках изолировать ЭК от различных органов (например, сердца, почек, печени и аорты), несколько протоколов были зарегистрированы в ксенотрансплантациипара8,9,10,11,12. Тем не менее, сохранение ультрачистой культуры изолированных ECs является нерешенной проблемой в стандартных протоколах. Повышенная концентрация переваренных растворов, ненадлежащее время пищеварения и интенсивность скобликов могут способствовать увеличению загрязнения фибробластом в текущих исследованиях8,10,13. Кроме того, менее изучен метод изолированных ПАЭК из миниатюрных свиней. Здесь мы описываем оптимизированный ферментативный метод изоляции высокоочищенных ПАЭК от миниатюрных свиней (Вугишань или Бама). Несколько этапов протокола были разработаны для уменьшения загрязнения фибробластов и получения высокой чистоты ECs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Эндотелиальные клетки широко используются в исследованиях сосудистой дисфункции, диабета, регенерации тканей, трансплантации, и рака14,15,16,17,18. Чтобы понять и охарактеризовать биологии и функции ECs …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа была поддержана грантами Фонда естественных наук провинции Гуандун, Грант/Наградный номер: 2016A03033028; Медицинский научно-исследовательский фонд провинции Гуандун, Грант/Наградный номер: B2018003; Шэньчжэньский фонд науки и техники, Грант/Наградный номер: JCYJ20180306172449376, JCYJ20180306172459580, JCJY201602220449975, GJH-20170314171135756, JCYJ201604251030001 1 и JCYJ20164 Фонд науки и техники округа Шэньчжэнь Лонгхуа, номер гранта/премии: 2017013; Национальная программа по НИОКР Китая, Грант/Номер премии: 2017YFC103704; Проект Sanming медицины в Шэньчжэне, Грант/Наградный номер: S’SM201412020; специальные средства на строительство больниц высокого уровня в провинции Гуандун (2019 год); Фонд для строительства медицинской дисциплины высокого уровня Шэньчжэнь, Грант/Наградный номер: 2016031638; Шэньчжэнь фонд здравоохранения и планирования семьи комиссии, Грант / Награда Номер: S’XJ2017021 и S’XJ2018059. Мы благодарим Ханчэн Чжан и Чжичэн Цзоу из Шэньчжэньского университета за помощь в подготовке рукописи.
Materials
| BD FACSAria II | BD Bioscience | ||
| Boneforceps | Beijing HeLi KeChuang Technology Development CO.,Ltd. China | HL-YGQ | |
| BOON Disposable Syringe (10ml) | Jiangsu Yile medical Article Co., Ltd. China | ||
| CD31-FITC antibody | Bio-Rad | MCA1746F | |
| Cell scraper | Corning | 3010# | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138#-1G | |
| Compound ketamine injection | Veterinary Pharmaceutical Factory of Shenyang, China | Ketamine Hydrochloride：0.3g/2ml,Xylazine hydrochloride:0.3g/2ml, Phenacetin hydrochloride：1mg/2ml | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Life Technologies | D1306# | |
| DMEM | Life Technologies | 11965118# | |
| ECM | Sciencell | 1001# | |
| ECGS | Sciencell | 1052# | |
| Eppendorf Snap-Cap Microtube(1.5mL) | AXYGEN | MCT-150-C# | |
| Falcon 100mm Cell Culture Dish | Corning | 353003# | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 10270-106# | |
| Flowjo v10.0 | |||
| Forceps | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | ||
| Heparin sodium | Jiangsu WanBang biopharmaceutical Co.,Ltd.China | ||
| Iodine tincture | Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China | ||
| Miniature Pig (Bama or Wuzhishan) | Kang Yi Ecological Agriculture Co., Ltd, China | ||
| Mshot microscope | Guangzhou Micro-shot Technology Co., Ltd. | M152 | |
| Petri Dishes (150 x 15 mm) | Biologixgroup | 66-1515# | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070063# | |
| Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vent Cap （T25） | Corning | 3289# | |
| Scissors | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | ||
| Serological Transfer Pipettes (10ml) | JET Biofil | GSP010010# | |
| Sterile Pasteur Pipette | GeneBrick | GY0025# | |
| Sterile Syringe Filter (0.22µm) | Millipore | SLGV033RS# | |
| Surgical scalpel | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | 22# | |
| Surgical suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., Ltd | 5-0# | |
| Syringe（5mL） | Shengguang Medical Instrument Co., Ltd.China | ||
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | GIBCO | 25200056# | |
| 75% Medical alcohol | Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China | ||
| 20 x PBS solution (pH 7.4,Nuclease free) | Sangon Biotech | B540627# | |
| Medical disinfectant 84 liquid | Sichuan Province Yijieshi Medical Technology Co., Ltd | 450ml/bottle |
References
- Zhang, G. Y., Liao, T., Fu, X. B., Li, Q. F. Organ transplantation in China: concerns remain. Lancet. 385 (9971), 854-855 (2015).
- Ekser, B., et al. Clinical xenotransplantation: the next medical revolution?. Lancet. 379 (9816), 672-683 (2012).
- Cooper, D. K., Ekser, B., Ramsoondar, J., Phelps, C., Ayares, D. The role of genetically engineered pigs in xenotransplantation research. The Journal of Pathology. 238 (2), 288-299 (2016).
- Pober, J. S., Sessa, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nature Reviews Immunology. 7 (10), 803-815 (2007).
- McGill, S. N., Ahmed, N. A., Christou, N. V. Endothelial cells: role in infection and inflammation. World Journal of Surgery. 22 (2), 171-178 (1998).
- Ekser, B., Cooper, D. K. Overcoming the barriers to xenotransplantation: prospects for the future. Expert Review of Clinical Immunology. 6 (2), 219-230 (2010).
- Yeom, H. J., et al. Porcine aortic endothelial cell genes responsive to selected inflammatory stimulators. The Journal of Veterinary Medical Science. 71 (11), 1499-1508 (2009).
- Beigi, F., et al. Optimized method for isolating highly purified and functional porcine aortic endothelial and smooth muscle cells. Journal of Cellular Physiology. 232 (11), 3139-3145 (2017).
- Jansen of Lorkeers, S. J., et al. Xenotransplantation of Human Cardiomyocyte Progenitor Cells Does Not Improve Cardiac Function in a Porcine Model of Chronic Ischemic Heart Failure. Results from a Randomized, Blinded, Placebo Controlled Trial. PLOS One. 10 (12), e0143953 (2015).
- Zhang, J., et al. Potential Antigens Involved in Delayed Xenograft Rejection in a Ggta1/Cmah Dko Pig-to-Monkey Model. Scientific Reports. 7 (1), 10024 (2017).
- Paris, L. L., et al. ASGR1 expressed by porcine enriched liver sinusoidal endothelial cells mediates human platelet phagocytosis in vitro. Xenotransplantation. 18 (4), 245-251 (2011).
- Paris, L. L., Chihara, R. K., Sidner, R. A., Tector, A. J., Burlak, C. Differences in human and porcine platelet oligosaccharides may influence phagocytosis by liver sinusoidal cells in vitro. Xenotransplantation. 19 (1), 31-39 (2012).
- Bernardini, C., et al. Heat shock protein 70, heat shock protein 32, and vascular endothelial growth factor production and their effects on lipopolysaccharide-induced apoptosis in porcine aortic endothelial cells. Cell Stress & Chaperones. 10 (4), 340-348 (2005).
- Endemann, D. H., Schiffrin, E. L. Endothelial dysfunction. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 15 (8), 1983-1992 (2004).
- Graupera, M., Claret, M. Endothelial Cells: New Players in Obesity and Related Metabolic Disorders. Trends in Endocrinology and Metabolism: TEM. 29 (11), 781-794 (2018).
- Kawamoto, A., Asahara, T., Losordo, D. W. Transplantation of endothelial progenitor cells for therapeutic neovascularization. Cardiovascular Radiation Medicine. 3 (3-4), 221-225 (2002).
- Rafii, S., Lyden, D. Therapeutic stem and progenitor cell transplantation for organ vascularization and regeneration. Nature Medicine. 9 (6), 702-712 (2003).
- Jain, R. K., et al. Endothelial cell death, angiogenesis, and microvascular function after castration in an androgen-dependent tumor: role of vascular endothelial growth factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (18), 10820-10825 (1998).
- Pratumvinit, B., Reesukumal, K., Janebodin, K., Ieronimakis, N., Reyes, M. Isolation, characterization, and transplantation of cardiac endothelial cells. BioMed Research International. 2013, 359412 (2013).
- Crouch, E. E., Doetsch, F. FACS isolation of endothelial cells and pericytes from mouse brain microregions. Nature Protocols. 13 (4), 738-751 (2018).
- Nakano, H., Nakano, K., Cook, D. N. Isolation and Purification of Epithelial and Endothelial Cells from Mouse Lung. Methods in Molecular Biology. 1799, 59-69 (2018).
- Naschberger, E., et al. Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma – An Improved Protocol. Journal of Visualized Experiments. (134), e57400 (2018).
- Yu, S., et al. Isolation and characterization of endothelial colony-forming cells from mononuclear cells of rat bone marrow. Experimental Cell Research. 370 (1), 116-126 (2018).
- Chi, L., Delgado-Olguin, P. Isolation and Culture of Mouse Placental Endothelial Cells. Methods in Molecular Biology. 1752, 101-109 (2018).
- Hawthorne, W. J., Lew, A. M., Thomas, H. E. Genetic strategies to bring islet xenotransplantation to the clinic. Current Opinion in Organ Transplantation. 21 (5), 476-483 (2016).
- Yi, E., et al. Mechanical Forces Accelerate Collagen Digestion by Bacterial Collagenase in Lung Tissue Strips. Frontiers in Physiology. 7, 287 (2016).
- Masson-Pevet, M., Jongsma, H. J., De Bruijne, J. Collagenase- and trypsin-dissociated heart cells: a comparative ultrastructural study. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 8 (10), 747-757 (1976).
- Yonenaga, K., et al. Optimal conditions of collagenase treatment for isolation of articular chondrocytes from aged human tissues. Regenerative Therapy. 6, 9-14 (2017).
- French, M. F., Mookhtiar, K. A., Van Wart, H. E. Limited proteolysis of type I collagen at hyperreactive sites by class I and II Clostridium histolyticum collagenases: complementary digestion patterns. Biochemistry. 26 (3), 681-687 (1987).
- Hara, H., et al. In vitro investigation of pig cells for resistance to human antibody-mediated rejection. Transplant International: Official Journal of the European Society for Organ Transplantation. 21 (12), 1163-1174 (2008).
- Takashima, A. Establishment of fibroblast cultures. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 2, 2.1.1-2.1.12 (2001).
