Aislamiento y cultivo de células endoteliales aórticas primarias de cerdos en miniatura
Summary
Se describe un método enzimático eficaz para el aislamiento de las células endoteliales aórticas porcinas primarias (pAEC) de los cerdos en miniatura. Los pAEC primarios aislados se pueden utilizar para investigar la respuesta inmunitaria y de la coagulación en el xenotrasplante.
Abstract
El xenotrasplante es una forma prometedora de resolver la escasez de órganos humanos para los pacientes con insuficiencia orgánica terminal, y el cerdo se considera como una fuente de órganos adecuada. El rechazo inmune y la coagulación son dos obstáculos importantes para el éxito del xenotrasplante. La lesión y la disfunción de la célula endotelial vascular (EC) son importantes para el desarrollo de las respuestas de inflamación y coagulación en xenotrasplante. Por lo tanto, el aislamiento de las células endoteliales aórticas porcinas (PAECs) es necesario para investigar el rechazo inmune y las respuestas de coagulación. Aquí, hemos desarrollado un enfoque enzimático simple para el aislamiento, caracterización y expansión de pAECs altamente purificados de cerdos en miniatura. En primer lugar, el cerdo en miniatura fue anestesiado con ketamina, y se extirpado una longitud de aorta. En segundo lugar, la superficie endotelial de la aorta fue expuesta a 0.005% solución digestiva de colágeno IV durante 15 min. En tercer lugar, la superficie endotelial de la aorta fue raspada en una sola dirección con un rascador celular (<10 veces), y no se comprimió durante el proceso de Raspado. Finalmente, los pAEC aislados del Día 3, y después del paso 1 y el pasaje 2, fueron identificados por citometría de flujo con un anticuerpo anti-CD31. Los porcentajes de células cd31 positivas fueron del 97,4% al 1,2%, del 94,4 % al 1,1% y del 92,4% al 1,7% (media de SD), respectivamente. La concentración de Colagenasa IV, el tiempo digestivo, la dirección y la frecuencia e intensidad del raspado son fundamentales para disminuir la contaminación por fibroblastos y obtener alta pureza y un gran número de CE. En conclusión, nuestro método enzimático es un método altamente eficaz para aislar las EF de la aorta de cerdo en miniatura, y las células se pueden ampliar in vitro para investigar las respuestas inmunitarias y de coagulación en el xenotrasplante.
Introduction
La escasez de órganos disponibles para trasplantes es un problema pendiente en todo el mundo1. Según la Cruz Roja de China, sólo un pequeño número de pacientes con insuficiencia orgánica en etapa terminal recibieron un órgano adecuado en China en 2018.
El xenotrasplante es una forma prometedora de resolver el problema de la escasez de órganos. Los órganos de cerdo son considerados los órganos másadecuados para los seres humanos debido a las similitudes anatómicas y fisiológicas 2,3. El fracaso de un xenoinjerto de cerdo está en gran medida relacionado con el rechazo inmune de primates y las respuestas de coagulación. Las células endoteliales porcinas (ECs) son críticas ya que estas células son las primeras en interactuar con el sistema inmunitario de primates, que incluye anticuerpos, complementos, citoquinas y células inmunitarias (por ejemplo, células T, células B y macrófagos)4,5. Las CE porcinas desempeñan un papel vital en el órgano de cerdo y el islotes xenotrasplante6,7. Por lo tanto, las CE son células importantes para investigar las respuestas de rechazo y coagulación a un injerto de cerdo. Se requiere aislamiento de eCs porcinas de alta calidad para la investigación de xenotrasplantes.
En intentos de aislar los ECs de diferentes órganos (por ejemplo, corazón, riñón, hígado y aorta), se han notificado varios protocolos en un entorno de xenotrasplante8,9,10,11,12. Sin embargo, mantener una cultura ultrapura de CE aislados es un problema excepcional en los protocolos estándar. El aumento de la concentración de la solución digerida, el tiempo dedigestión inapropiado y la intensidad del raspado pueden contribuir al aumento de la contaminación por fibroblastos en los estudios actuales 8,10,13. Además, el método de pAECs aislados de cerdos en miniatura está menos estudiado. Aquí, describimos un método enzimático optimizado para aislar pAEC altamente purificados de cerdos en miniatura (Wuzhishan o Bama). Se han diseñado varios pasos en el protocolo para reducir la contaminación por fibroblastos y obtener eCs de alta pureza.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las células endoteliales se utilizan comúnmente en la investigación de la disfunción vascular, diabetes, regeneración de tejidos, trasplante, y cánceres14,15,16,17,18. Para comprender y caracterizar la biología y la función de las CE en estas enfermedades, se han notificado numerosos métodos para aislar las CE de diferentes órganos o tejidos enfermos…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Guangdong, Número de Subvención/Premio: 2016A030313028; Fundación de Investigación Científica Médica de la Provincia de Guangdong, Número de Subvención/Premio: B2018003; Shenzhen Foundation of Science and Technology, Número de subvención/premio: JCYJ20180306172449376, JCYJ20180306172459580, JCJY2016029204849975, GJHZ20170314171357556, JCYJ20160425103000011 y JCYJ201604281420409945; Shenzhen Longhua District Foundation of Science and Technology, Número de Subvención/Premio: 2017013; Programa Nacional Clave de I+D de China, Número de Subvención/Premio: 2017YFC1103704; Sanming Project of Medicine en Shenzhen, Número de subvención/premio: SZSM201412020; Fondos Especiales para la Construcción de Hospitales de Alto Nivel en la Provincia de Guangdong (2019); Fondo para la construcción de disciplina médica de alto nivel de Shenzhen, número de subvención/premio: 2016031638; Comisión de La Fundación de Salud y Planificación Familiar de Shenzhen, Número de Subvención/Premio: SZXJ2017021 y SZXJ2018059. Agradecemos a Hancheng Zhang y Zhicheng Zou de la Universidad de Shenzhen por ayudar en la preparación del manuscrito.
Materials
| BD FACSAria II | BD Bioscience | ||
| Boneforceps | Beijing HeLi KeChuang Technology Development CO.,Ltd. China | HL-YGQ | |
| BOON Disposable Syringe (10ml) | Jiangsu Yile medical Article Co., Ltd. China | ||
| CD31-FITC antibody | Bio-Rad | MCA1746F | |
| Cell scraper | Corning | 3010# | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138#-1G | |
| Compound ketamine injection | Veterinary Pharmaceutical Factory of Shenyang, China | Ketamine Hydrochloride：0.3g/2ml,Xylazine hydrochloride:0.3g/2ml, Phenacetin hydrochloride：1mg/2ml | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Life Technologies | D1306# | |
| DMEM | Life Technologies | 11965118# | |
| ECM | Sciencell | 1001# | |
| ECGS | Sciencell | 1052# | |
| Eppendorf Snap-Cap Microtube(1.5mL) | AXYGEN | MCT-150-C# | |
| Falcon 100mm Cell Culture Dish | Corning | 353003# | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 10270-106# | |
| Flowjo v10.0 | |||
| Forceps | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | ||
| Heparin sodium | Jiangsu WanBang biopharmaceutical Co.,Ltd.China | ||
| Iodine tincture | Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China | ||
| Miniature Pig (Bama or Wuzhishan) | Kang Yi Ecological Agriculture Co., Ltd, China | ||
| Mshot microscope | Guangzhou Micro-shot Technology Co., Ltd. | M152 | |
| Petri Dishes (150 x 15 mm) | Biologixgroup | 66-1515# | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070063# | |
| Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vent Cap （T25） | Corning | 3289# | |
| Scissors | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | ||
| Serological Transfer Pipettes (10ml) | JET Biofil | GSP010010# | |
| Sterile Pasteur Pipette | GeneBrick | GY0025# | |
| Sterile Syringe Filter (0.22µm) | Millipore | SLGV033RS# | |
| Surgical scalpel | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | 22# | |
| Surgical suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., Ltd | 5-0# | |
| Syringe（5mL） | Shengguang Medical Instrument Co., Ltd.China | ||
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | GIBCO | 25200056# | |
| 75% Medical alcohol | Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China | ||
| 20 x PBS solution (pH 7.4,Nuclease free) | Sangon Biotech | B540627# | |
| Medical disinfectant 84 liquid | Sichuan Province Yijieshi Medical Technology Co., Ltd | 450ml/bottle |
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