Anvendelse af atomkraften mikroskopi til måling af mekaniske egenskaber og turgor tryk af planteceller og plantevæv
Summary
Her præsenterer vi atomkraften mikroskopi (AFM), der drives som et nano-og mikro-indryknings værktøj på celler og væv. Instrumentet giver mulighed for samtidig erhvervelse af 3D-overfladetopografi af prøven og dens mekaniske egenskaber, herunder Cell Wall Youngs modulus samt turgor tryk.
Abstract
Vi præsenterer her brugen af atomkraften mikroskopi til at indrykke plantevæv og genvinde sine mekaniske egenskaber. Ved hjælp af to forskellige mikroskoper i indrykningstilstand viser vi hvordan man måler en elastisk modulus og bruger den til at evaluere cellevæggens mekaniske egenskaber. Derudover forklarer vi også, hvordan man evaluerer turgor-trykket. De vigtigste fordele ved atomkraften mikroskopi er, at det er ikke-invasiv, relativt hurtig (5 ~ 20 min), og at stort set enhver form for levende plante væv, der er overfladisk flad kan analyseres uden behov for behandling. Opløsningen kan være meget god, afhængigt af spids størrelsen og antallet af målinger pr. arealenhed. En begrænsning af denne metode er, at det kun giver direkte adgang til det overfladiske cellelag.
Introduction
Atomkraften mikroskopi (AFM) tilhører scannings sonden mikroskopi (SPM) familie, hvor et tip med en radius af normalt et par nanometer scanner overfladen af en prøve. Påvisning af en overflade opnås ikke ved hjælp af optiske eller elektron baserede metoder, men via interaktions kræfterne mellem spidsen og prøveoverfladen. Således er denne teknik ikke begrænset til topografiske karakterisering af en prøve flade (3D-opløsning, der kan gå ned til et par nanometer), men giver også mulighed for måling af enhver form for interaktion kræfter såsom elektrostatiske, Van der Waals eller kontakt kræfter. Desuden kan spidsen bruges til at anvende kræfter på overfladen af en biologisk prøve og måle den resulterende deformation, den såkaldte “indrykning”, for at bestemme dens mekaniske egenskaber (f. eks. Youngs modulus, viskoelastiske egenskaber).
Mekaniske egenskaber af plante cellevægge er afgørende for at blive taget i betragtning, når de forsøger at forstå mekanismer underliggende udviklingsmæssige processer1,2,3. Faktisk, disse egenskaber er stramt kontrolleret under udvikling, især da cellevæg blødgøring er nødvendig for at tillade celler til at vokse. AFM kan bruges til at måle disse egenskaber og studere den måde, de skifter mellem organer, væv eller udviklingsmæssige stadier.
I dette papir beskriver vi, hvordan vi bruger AFM til at måle både cellmur mekaniske egenskaber og turgor tryk. Disse to applikationer er demonstreret på to forskellige AFM mikroskoper og er detaljeret her efter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fremkomsten af former i planter er primært bestemt af den koordinerede hastighed og retning af vækst i tid og rum. Planteceller er indkapslet i en stiv cellevæg lavet af en polysaccharidic matrix, som lim dem sammen. Som et resultat, celle ekspansion styres af balancen mellem turgor tryk trækker på cellens væg, og stivhed af cellens væg modstå dette pres. For at forstå de mekanismer underliggende udvikling, er det vigtigt at være i stand til at måle både cellevæg mekaniske egenskaber samt turgor tryk i forsk…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke PLATIM team for deres tekniske support, samt Arezki Boudaoud og medlemmer af biophysic team på RDP Lab for nyttige diskussioner.
Materials
| Growth medium | |||
| 1000x vimatin stock solution | used to make ACM, composition see Stanislas et al., 2017. Add to ACM after autoclaving, before pouring. | ||
| 1-N-Naphthylphthalamic acid (NPA) | Sigma-Aldrich/Merck | 132-66-1 | add to Arabidopsis medium, 10 μM. Add after autoclaving, before pouring. |
| agar-agar | Sigma-Aldrich/Merck | 9002-18-0 | add to Arabidopsis medium, 1% w/v. |
| agarose | Merck Millipore | 9012-36-6 | used to make solid ACM, 0.8% w/v. |
| Arabidopsis medium | Duchefa Biochimie | DU0742.0025 | For in vitro arabidopsis culture, 11.82g/L. |
| Calcium nitrate tetrahydrate | Sigma-Aldrich/Merck | 13477-34-4 | add to Arabidopsis medium, 2mM. |
| MURASHIGE & SKOOG MEDIUM | Duchefa Biochimie | M0221.0025 | Basal salt mixture, used to make ACM, 2.2g/L. |
| N6-benzyladenine (BAP) | Sigma-Aldrich/Merck | 1214-39-7 | used to make ACM, 555 nM. Add to ACM after autoclaving, before pouring. |
| oryzalin | Sigma-Aldrich/Merck | 19044-88-3 | for oryzalin treatement, 10 μg/mL. |
| plant preservation mixture (PPM) | Plant Cell Technology | used to make ACM, 0.1% v/v. Add to ACM after autoclaving, before pouring. | |
| Potassium hydroxide | Duchefa Biochimie | 1310-58-3 | used to make Arabidopsis medium and ACM, both pH 5.8. |
| sucrose | Duchefa Biochimie | 57-50-1 | used to make ACM, 1% w/v. |
| Tools for AFM | |||
| BioScope Catalyst BioAFM | Bruker | The AFM used for turgor pressure measurement in this protocol. | |
| Nanowizard III + CellHesion | JPK (Bruker) | The AFM used for measuring mechanical properties. | |
| Patafix | UHU | D1620 | |
| Reference elasitic structure | NanoIdea | 2Z00026 | |
| Reprorubber-Thin Pour | Flexbar | 16135 | biocompatible glue. |
| Spherical AFM tips | Nanoandmore | SD-SPHERE-NCH-S-10 | Tips used for measuring mechanical properties. |
References
- Du, F., Guan, C., Jiao, Y. Molecular mechanisms of leaf morphogenesis. Molecular Plant. 11, 1117-1134 (2018).
- Cosgrove, D. J. Growth of the plant cell wall. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 850-861 (2005).
- Dumais, J. Can mechanics control pattern formation in plants?. Current Opinion in Plant Biology. 10, 58-62 (2007).
- Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. Early flower development in Arabidopsis. The Plant Cell. 2, 755-767 (1990).
- Routier-Kierzkowska, A. L., et al. Cellular force microscopy for in vivo measurements of plant tissue mechanics. Plant Physiology. 158 (4), 1514-1522 (2012).
- Corson, F., et al. Turning a plant tissue into a living cell froth through isotropic growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 8453-8458 (2009).
- Hervieux, N., et al. A mechanical feedback restricts sepal growth and shape in Arabidopsis. Current Biology. 26, 1019-1028 (2016).
- Stanislas, T., Hamant, O., Traas, J., Lecuit, T. Chapter 11 – In-vivo analysis of morphogenesis in plants. Methods in Cell. 139, 203-223 (2017).
- Beauzamy, L., Derr, J., Boudaoud, A. Quantifying hydrostatic pressure in plant cells using indentation with an atomic force microscope. Biophysical Journal. 108 (10), 2448-2456 (2015).
- Costa, K. D., Sim, A. J., Yin, F. C. P. Non-Hertzian Approach to Analyzing Mechanical Properties of Endothelial Cells Probed by Atomic Force Microscopy. Journal of Biomechanical Engineering. 128 (2), 176-184 (2006).
- Beauzamy, L., Louveaux, M., Hamant, O., Boudaoud, A. Mechanically, the shoot apical meristem of Arabidopsis behaves like a shell inflated by a pressure of about 1MPa. Frontiers in Plant science. 6 (1038), 1-10 (2015).
- Majda, M., et al. Mechanochemical polarization of contiguous cell walls shapes plant pavement cells. Developmental Cell. 43 (3), 290-304 (2017).
- Torode, T. A., et al. Branched pectic galactan in phloem-sieve-element cell walls: implications for cell mechanics. Plant Physiology. 176, 1547-1558 (2018).
- Farahi, R. H., et al. Plasticity, elasticity, and adhesion energy of plant cell walls: nanometrology of lignin loss using atomic force microscopy. Scientific Reports. 7, 152 (2017).
- Peaucelle, A., et al. Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis. Current Biology. 21, 1720-1726 (2011).
- Cosgrove, D. J. Diffuse growth of plant cell walls. Plant Physiology. 176, 16-27 (2018).
- Sader, J. E., Larson, I., Mulvaney, P., White, L. R. Method for the calibration of atomic force microscope cantilevers. Review of Scientific Instruments. 66 (7), 3789-3798 (1995).
- Sader, J. E., Chon, J. W. M., Mulvaney, P. Calibration of rectangular atomic force microscope cantilevers. Review of Scientific Instruments. 70 (10), 3967-3969 (1999).
- Sikora, A. Quantitative Normal Force Measurements by Means of Atomic Force Microscopy Towards the Accurate and Easy Spring Constant Determination. Nanoscience and Nanometrology. 2 (1), 8-29 (2016).
- Schillers, H., et al. Standardized Nanomechanical Atomic Force Microscopy Procedure (SNAP) for Measuring Soft and Biological Samples. Scientific Reports. 7 (1), (2017).
