Einsatz der Atomkraftmikroskopie zur Messung mechanischer Eigenschaften und Turgordruck von Pflanzenzellen und Pflanzengeweben
Summary
Hier präsentieren wir Die Atomkraftmikroskopie (AFM), die als Nano- und Mikroeindrüsenwerkzeug für Zellen und Gewebe betrieben wird. Das Gerät ermöglicht die gleichzeitige Erfassung der 3D-Oberflächentopographie der Probe und ihrer mechanischen Eigenschaften, einschließlich zellwandiger Young-Moduls sowie Turgordruck.
Abstract
Wir stellen hier den Einsatz der Atomkraftmikroskopie vor, um Pflanzengewebe einzurücken und seine mechanischen Eigenschaften wiederzuerlangen. Anhand von zwei verschiedenen Mikroskopen im Einzugsmodus zeigen wir, wie man einen elastischen Modul misst und damit mechanische Eigenschaften der Zellwand bewertet. Darüber hinaus erklären wir auch, wie der Turgordruck bewertet wird. Die Hauptvorteile der Atomkraftmikroskopie sind, dass sie nicht-invasiv, relativ schnell (5 bis 20 min) ist und dass praktisch jede Art von lebendem Pflanzengewebe, das oberflächlich flach ist, ohne Behandlungsbedarf analysiert werden kann. Die Auflösung kann sehr gut sein, abhängig von der Spitzengröße und der Anzahl der Messungen pro Flächeneinheit. Eine Einschränkung dieser Methode ist, dass sie nur direkten Zugriff auf die oberflächliche Zellschicht gewährt.
Introduction
Die Atomkraftmikroskopie (AFM) gehört zur Scan-Sondenmikroskopie-Familie (SPM), bei der eine Spitze mit einem Radius von in der Regel wenigen Nanometern die Oberfläche einer Probe scannt. Die Detektion einer Oberfläche erfolgt nicht über optische oder elektronenbasierte Methoden, sondern über die Wechselwirkungskräfte zwischen der Spitze und der Probenoberfläche. Somit beschränkt sich diese Technik nicht auf die topographische Charakterisierung einer Probenoberfläche (3D-Auflösung, die auf wenige Nanometer sinken kann), sondern ermöglicht auch die Messung jeder Art von Wechselwirkungskräften wie Elektrostatik, Van der Waals oder Kontaktkräften. Darüber hinaus kann die Spitze verwendet werden, um Kräfte an der Oberfläche einer biologischen Probe anzuwenden und die resultierende Verformung, die sogenannte “Einrückung”, zu messen, um ihre mechanischen Eigenschaften (z.B. Young-Modul, viskoelastische Eigenschaften) zu bestimmen.
Mechanische Eigenschaften von Pflanzenzellwänden sind wichtig, um bei dem Versuch, Mechanismen zu verstehen, die Entwicklungsprozessen zugrunde liegen,1,2,3zu berücksichtigen. Tatsächlich werden diese Eigenschaften während der Entwicklung streng kontrolliert, insbesondere da eine Zellwandenthärtung erforderlich ist, damit Zellen wachsen können. AFM kann verwendet werden, um diese Eigenschaften zu messen und zu untersuchen, wie sie zwischen Organen, Geweben oder Entwicklungsstadien wechseln.
In diesem Artikel beschreiben wir, wie wir AFM verwenden, um sowohl die mechanischen Eigenschaften der Zellwand als auch den Turgordruck zu messen. Diese beiden Anwendungen werden auf zwei verschiedenen AFM-Mikroskopen demonstriert und werden hier danach detailliert beschrieben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Entstehung von Formen in Pflanzen wird hauptsächlich durch die koordinierte Geschwindigkeit und Wachstumsrichtung in Zeit und Raum bestimmt. Pflanzenzellen sind in einer starren Zellwand aus einer polysaccharidischen Matrix eingeschlossen, die sie zusammenklebt. Dadurch wird die Zellausdehnung durch das Gleichgewicht zwischen dem Turgordruck, der an der Zellwand zieht, und der Steifigkeit der Zellwand gesteuert, die diesem Druck standhält. Um die Mechanismen zu verstehen, die der Entwicklung zugrunde liegen, ist es…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken dem PLATIM-Team für die technische Unterstützung sowie Arezki Boudaoud und Mitgliedern des Biophysic-Teams im RDP-Labor für hilfreiche Diskussionen.
Materials
| Growth medium | |||
| 1000x vimatin stock solution | used to make ACM, composition see Stanislas et al., 2017. Add to ACM after autoclaving, before pouring. | ||
| 1-N-Naphthylphthalamic acid (NPA) | Sigma-Aldrich/Merck | 132-66-1 | add to Arabidopsis medium, 10 μM. Add after autoclaving, before pouring. |
| agar-agar | Sigma-Aldrich/Merck | 9002-18-0 | add to Arabidopsis medium, 1% w/v. |
| agarose | Merck Millipore | 9012-36-6 | used to make solid ACM, 0.8% w/v. |
| Arabidopsis medium | Duchefa Biochimie | DU0742.0025 | For in vitro arabidopsis culture, 11.82g/L. |
| Calcium nitrate tetrahydrate | Sigma-Aldrich/Merck | 13477-34-4 | add to Arabidopsis medium, 2mM. |
| MURASHIGE & SKOOG MEDIUM | Duchefa Biochimie | M0221.0025 | Basal salt mixture, used to make ACM, 2.2g/L. |
| N6-benzyladenine (BAP) | Sigma-Aldrich/Merck | 1214-39-7 | used to make ACM, 555 nM. Add to ACM after autoclaving, before pouring. |
| oryzalin | Sigma-Aldrich/Merck | 19044-88-3 | for oryzalin treatement, 10 μg/mL. |
| plant preservation mixture (PPM) | Plant Cell Technology | used to make ACM, 0.1% v/v. Add to ACM after autoclaving, before pouring. | |
| Potassium hydroxide | Duchefa Biochimie | 1310-58-3 | used to make Arabidopsis medium and ACM, both pH 5.8. |
| sucrose | Duchefa Biochimie | 57-50-1 | used to make ACM, 1% w/v. |
| Tools for AFM | |||
| BioScope Catalyst BioAFM | Bruker | The AFM used for turgor pressure measurement in this protocol. | |
| Nanowizard III + CellHesion | JPK (Bruker) | The AFM used for measuring mechanical properties. | |
| Patafix | UHU | D1620 | |
| Reference elasitic structure | NanoIdea | 2Z00026 | |
| Reprorubber-Thin Pour | Flexbar | 16135 | biocompatible glue. |
| Spherical AFM tips | Nanoandmore | SD-SPHERE-NCH-S-10 | Tips used for measuring mechanical properties. |
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