対流強化送達によるマウス脳への抗体の送達
Summary
対流増強送達(CED)は、大きな組織体積を直接灌流することにより、脳への治療薬の効果的な送達を可能にする方法である。プロシージャはカテーテルおよび最大限に活用された注入プロシージャの使用を要求する。このプロトコルは、マウス脳に抗体のCEDのための方法論を説明する。
Abstract
対流増強送達(CED)は、カテーテルシステムを使用して大きな脳容積の効果的な灌流を可能にする神経外科技術である。このようなアプローチは、血液脳関門(BBB)を通過して安全な送達方法を提供し、従って、毒性による全身暴露が望ましくない治療を可能にする。CEDは、カテーテルの設計、注入プロトコル、およびインフューサートの特性の最適化を必要とします。このプロトコルでは、マウスのコーデートプタメンに最大20 μgの抗体を含む溶液のCEDを実行する方法を説明する。ステップカテーテルの調製、インビトロでの試験、ランピング注射プログラムを用いたマウスでのCEDの実行について説明します。プロトコルは、他の注入量のために容易に調整することができ、化学療法、サイトカイン、ウイルス粒子、およびリポソームを含む様々なトレーサーまたは薬理学的に活性または不活性な物質を注入するために使用することができます。
Introduction
血液脳関門(BBB)は、中枢神経系(CNS)と血液循環を分離する半透過性境界を形成する。しかし、治療薬でCNSに到達することは、脳腫瘍、アルツハイマー病(AD)またはパーキンソン病(PD)などの様々な疾患の文脈において必要である1。これは、新しい治療法の開発において重要になり、特に試験された薬物がBBB透過性が悪い場合またはその全身暴露が危険な毒性1、2につながる可能性がある場合。臨床的に使用される抗体のいくつかは、これらの特徴の両方を表示する。この問題の解決策は、BBBの真後ろに治療薬を提供することです。
対流増強送達(CED)は、大きな脳容積の効果的な灌流を可能にする神経外科技術である。これは、1つ以上のカテーテルを対象領域に外科的に取り付けることによって達成される。薬物塗布中に、カテーテルの開口部に圧力勾配が形成され、これは組織3、4におけるインフューサテ分散の駆動力となる。したがって、灌流範囲2、4、5を決定する拡散係数ではなく、注入の持続時間です。これは、従来と比較してはるかに大きな脳容積にわたってインフュージョンの均一な送達を提供し、脳内注射法2,6に基づく拡散を行う。同時に、この配信モダリティは、組織損傷2のリスクが低い。したがって、CEDは、CNS腫瘍の治療のための従来の化学療法薬の安全かつ有効な投与を可能にするだけでなく、他のCNS障害の多数における免疫調節剤またはアゴニストおよび拮抗抗体の送達を可能にする2 、7,8,9.CEDは現在、パーキンソン病、アルツハイマー病、ならびに高品位の神経膠腫2、7、8、10、11の治療で試験されている。
カテーテルの設計および注入のレジメンはCED 10、12、13、14、15、16の結果に影響を与える最も重要な要因の1つである。 さらに、それは、粒子の適度なサイズ、アニオン電荷、および低組織親和性10、17を含む、インフューザーの特定の物理化学的特性を必要とする。これらのパラメータのそれぞれは、標的にされる脳領域の組織学的特徴に従って潜在的に調整されなければならない 2,10,17.
ここでは、マウスのコーデートプタメン(線条体)に抗体溶液のCEDを行うための方法論について説明する。さらに、プロトコルは実験室のセットアップのステップカテーテルの準備を含み、インビトロでそれらをテストし、CEDを行う。
カニューレの形状、使用される材料、カテーテルの開口部の数によって異なる複数のカテーテルの設計があり、12、15、18、19、20 、21、22。鈍い端の金属の針から1mm突出した融合シリカキャピラリー製のステップカテーテルを使用しています。このカテーテルの設計は実験室で容易に製造することができ、生体内の脳のパレンキマに似た物理的なパラメータを持つアガロースブロックとインビトロでテストされると、良好なCED結果を生み出すことができます。
さらに、生体内で5μLのインフューサトを送送るためのランピングレジメンを実装しています。このようなプロトコルでは、射出速度が0.2 μL/minから最大0.8 μL/minに増加し、カテーテルに沿った逆流の可能性と組織損傷のリスクを最小限に抑えます16。このプロトコルを用いて、11分30秒の間にPBSの5μLで最大20 μgの抗体を有するマウスを正常に投与した。
プロトコルは、他の注入量のために容易に調整することができるか、または様々な他の物質、例えば、化学療法、サイトカイン、ウイルス粒子またはリポソーム2、10、14、18を注入する、22.抗体のリン酸緩衝生理食べ物(PBS)または人工脳脊髄液(aCSF)溶液と比較して、大幅に異なる物理化学的特性を有するインフュー酸塩を使用する場合は、追加の検証ステップが推奨されます。カテーテルアセンブリ、検証およびCEDのために、我々は通常の立体フレームに取付けられるドリルおよび注入の単位が付いている立体ロボットを使用してすべてのステップを記述する。この手順はまた、記載されたガラスマイクロシリンジを駆動することができるプログラム可能なマイクロ注入ポンプに接続された手動定位フレームで行うことができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
対流増強送達、または脳への圧力媒介薬物注入は、1990年初頭に最初に提案された3.このアプローチは、制御された方法で血液脳関門の背後にある大きな脳体の灌流を約束します2.しかし、これまでのところ、このアプローチを用いて行われた臨床試験はごくわずかであり、一部は臨床セットアップにおけるCEDが技術的に要求が厳しい24、25<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、チューリッヒ大学(FK-15-057)、ノバルティス医学生物学財団(16C231)、スイス癌研究(KFS-3852-02-2016、KFS-4146-02-2017)のヨハネス・ヴォーム・ベルクとBRIDGEの実証概念(2017)の助成金によって支援されました。_177300) リンダ・シェルハンマー
Materials
| 10 μL syringe | Hamilton | 7635-01 | |
| 27 G blunt end needle | Hamilton | 7762-01 | |
| Agarose | Promega | V3121 | |
| Atipamezol | Janssen | ||
| Bone wax | Braun | 1029754 | |
| Buprenorphine | Indivior Schweiz AG | ||
| Carprofen | Pfizer AG | ||
| Dental drill bits, steel, size ISO 009 | Hager & Meisinger | 1RF009 | |
| Ethanol 100% | Reuss-Chemie AG | 179-VL03K-/1 | |
| Fentanyl | Helvepharm AG | ||
| FITC-Dextran, 2000 kDa | Sigma Aldrich | FD2000S | |
| Flumazenil | Labatec Pharma AG | ||
| Formaldehyde | Sigma Aldrich | F8775-500ML | |
| High viscosity cyanoacrylate glue | Migros | ||
| Iodine solution | Mundipharma | ||
| Medetomidin | Orion Pharma AG | ||
| Microforge | Narishige | MF-900 | |
| Midazolam | Roche Pharma AG | ||
| Ophthalmic ointment | Bausch + Lomb | Vitamin A Blache | |
| PBS | ThermoFischer Scientific | 10010023 | |
| Polyclonal goat anti-rat IgG (H+L) antibody coupled with Alexa Fluor 647 | Jackson Immuno | ||
| Scalpels | Braun | BB518 | |
| Silica tubing internal diameter 0.1 mm, wall thickness of 0.0325 mm | Postnova | Z-FSS-100165 | |
| Stereotactic frame for mice | Stoelting | 51615 | |
| Stereotactic robot | Neurostar | Drill and Injection Robot | |
| Succrose | Sigma Aldrich | S0389-500G | |
| Topical tissue adhesive | Zoetis | GLUture | |
| Trypan blue | ThermoFischer Scientific | 15250061 | |
| Water | Bichsel | 1000004 |
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