Entrega de anticorpos para o cérebro murino via convecção-fornecimento aprimorado
Summary
A entrega reforçada por convecção (CED) é um método que permite a efetiva entrega da terapêutica no cérebro por perfusão direta de grandes volumes de tecido. O procedimento requer o uso de cateteres e um procedimento de injeção otimizado. Este protocolo descreve uma metodologia para CED de um anticorpo em um cérebro do rato.
Abstract
A entrega reforçada por convecção (CED) é uma técnica neurocirúrgica que permite a perfusão efetiva de grandes volumes cerebrais usando um sistema de cateter. Tal aproximação fornece um método seguro da entrega que passa a barreira do cérebro de sangue (BBB), assim permitindo o tratamento com a terapêutica com o BBB-permeabilidade pobre ou aqueles para que a exposição sistemática não é desejada, por exemplo, devido à toxicidade. O CED exige a optimização do projeto do cateter, do protocolo da injeção, e das propriedades do infusate. Com este protocolo nós descrevemos como executar o CED de uma solução que contem até 20 μg de um anticorpo no putamen caudado dos ratos. Descreve a preparação de cateteres de degrau, testando-os in vitro e realizando o CED em camundongos usando um programa de injeção em rampa. O protocolo pode ser prontamente ajustado para outros volumes de infusão e pode ser usado para injetar vários traçadores ou substâncias farmacologicamente ativas ou inativas, incluindo quimioterápicos, citocinas, partículas virais e lipossomas.
Introduction
A barreira hematoencefálica (BBB) forma uma borda semipermeável separando o sistema nervoso central (SNC) da circulação sanguínea. Alcançar o CNS com terapêutica é entretanto necessário no contexto de várias doenças, como tumores cerebrais, doença de Alzheimer (AD) ou doença de Parkinson (PD) entre outros1. Isto torna-se importante no desenvolvimento de novas terapias, especialmente se a droga testada exibe permeabilidade BBB pobre ou a sua exposição sistémica pode levar a toxicidade perigosa1,2. Alguns dos anticorpos clinicamente utilizados exibem ambas estas características. Uma solução para este problema seria a de entregar a terapêutica diretamente por trás do BBB.
A entrega reforçada por convecção (CED) é uma técnica neurocirúrgica que permite a perfusão efetiva de grandes volumes cerebrais. Isto é conseguido cirurgicamente instalando um ou mais cateteres na área alvo. Durante a aplicação da droga, um gradiente de pressão é formado na abertura do cateter, que se torna a força motriz da dispersão do infusato no tecido3,4. É, portanto, a duração da infusão e não os coeficientes de difusão que determinam a faixa de perfusão2,4,5. Isto fornece a entrega uniforme do infusato sobre um volume muito maior do cérebro comparado ao convencional, a difusão baseou métodos intracerebral da injeção2,6. Ao mesmo tempo, esta modalidade da entrega tem um risco mais baixo de dano de tecido2. Consequentemente, o CED pode permitir a administração segura e eficaz da quimioterapêutica convencional para o tratamento de tumores do CNS, assim como a entrega de agentes imunomoduladores ou de anticorpos agonístico e antagônicas em uma multidão de outras desordens do CNS2 ,7,8,9. CED é atualmente testado em terapias da doença de Parkinson, a doença de Alzheimer, bem como glioma de alto grau2,7,8,10,11.
O delineamento do cateter e o esquema de injeção estão entre os fatores mais importantes que influenciam o desfecho do CED 10,12,13,14,15,16. Além disso, requer propriedades físico-químicas específicas do infusato, incluindo tamanho moderado das partículas, carga aniônica e baixa afinidade tecidual 10,17. Cada um destes parâmetros tem que ser ajustado potencialmente de acordo com as características histológicas da região do cérebro a ser alvejada2,10,17.
Aqui nós descrevemos a metodologia para executar o CED de uma solução do anticorpo no putamen caudado (striatum) dos ratos. Além disso, o protocolo inclui a preparação de cateteres de degrau em uma instalação laboratorial, testando-os in vitro e realizando o CED.
Existem vários projetos de cateter disponíveis na literatura, diferindo pela forma da cânula, os materiais utilizados e o númerode aberturas de cateter12,15,18,19,20 ,21,22. Nós estamos usando um cateter da etapa feito de um capilar fundido do silicone que projeta 1 milímetro de uma agulha sem corte do metal da extremidade. Este projeto do cateter pode facilmente ser manufacturado em um laboratório de pesquisa e dá resultados bons de CED quando testado in vitro com blocos do agarose com parâmetros físicos que assemelham-se ao parênquima do cérebro in vivo23.
Além disso, nós implementamos um regime de rampa para a entrega de 5 μL de infusato in vivo. Em tal protocolo, a taxa de injeção é aumentada de 0,2 μL/min para um máximo de 0,8 μL/min, minimizando assim as chances de refluxo infusato ao longo do cateter, bem como o risco de dano tecidual16. Usando este protocolo, nós administramos com sucesso ratos com os até 20 μg do anticorpo em 5 μL de PBS sobre o curso de 11 minutos 30 s.
O protocolo pode ser prontamente ajustado para outros volumes de infusão ou para injetar várias outras substâncias, por exemplo, quimioterápicos, citocinas, partículas virais ou lipossomas2,10,14,18 ,22. Em caso do uso do infusato com propriedades físico-químicas drasticamente diferentes comparadas a uma solução salina tamponada fosfato (PBS) ou do líquido cerebrospinal artificial (ACSF) de anticorpos, as etapas adicionais da validação são recomendadas. Para o conjunto do cateter, a validação e o CED, nós descrevemos todas as etapas usando um robô stereotactic com uma unidade da broca e da injeção montada em um frame stereotactic regular. Este procedimento pode igualmente ser executado com um frame stereotactic manual conectado à bomba programável da microinfusão que pode conduzir as Microseringas de vidro descritas.
Protocol
Representative Results
Discussion
A entrega aumentada convecção, ou a infusão pressão-negociada da droga no cérebro, foram propor primeiramente no adiantado 19903. Esta aproximação promete a perfusão de grandes volumes do cérebro atrás da barreira do cérebro do sangue em uma maneira controlada2. No entanto, até agora, apenas alguns ensaios clínicos têm sido realizados usando essa abordagem, parcialmente porque CED em uma configuração clínica mostrou ser tecnicamente exigente<sup class="xref…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por subsídios da Universidade de Zurique (FK-15-057), a Fundação Novartis para pesquisa médico-biológica (16C231) e pesquisa de câncer suíço (KFS-3852-02-2016, KFS-4146-02-2017) para Johannes vom Berg e ponte prova de conceito (20B1-1 _ 177300) para linda Schellhammer.
Materials
| 10 μL syringe | Hamilton | 7635-01 | |
| 27 G blunt end needle | Hamilton | 7762-01 | |
| Agarose | Promega | V3121 | |
| Atipamezol | Janssen | ||
| Bone wax | Braun | 1029754 | |
| Buprenorphine | Indivior Schweiz AG | ||
| Carprofen | Pfizer AG | ||
| Dental drill bits, steel, size ISO 009 | Hager & Meisinger | 1RF009 | |
| Ethanol 100% | Reuss-Chemie AG | 179-VL03K-/1 | |
| Fentanyl | Helvepharm AG | ||
| FITC-Dextran, 2000 kDa | Sigma Aldrich | FD2000S | |
| Flumazenil | Labatec Pharma AG | ||
| Formaldehyde | Sigma Aldrich | F8775-500ML | |
| High viscosity cyanoacrylate glue | Migros | ||
| Iodine solution | Mundipharma | ||
| Medetomidin | Orion Pharma AG | ||
| Microforge | Narishige | MF-900 | |
| Midazolam | Roche Pharma AG | ||
| Ophthalmic ointment | Bausch + Lomb | Vitamin A Blache | |
| PBS | ThermoFischer Scientific | 10010023 | |
| Polyclonal goat anti-rat IgG (H+L) antibody coupled with Alexa Fluor 647 | Jackson Immuno | ||
| Scalpels | Braun | BB518 | |
| Silica tubing internal diameter 0.1 mm, wall thickness of 0.0325 mm | Postnova | Z-FSS-100165 | |
| Stereotactic frame for mice | Stoelting | 51615 | |
| Stereotactic robot | Neurostar | Drill and Injection Robot | |
| Succrose | Sigma Aldrich | S0389-500G | |
| Topical tissue adhesive | Zoetis | GLUture | |
| Trypan blue | ThermoFischer Scientific | 15250061 | |
| Water | Bichsel | 1000004 |
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